Лептин (ген гена) південноафриканської кігтячої жаби Xenopus laevis PNAS

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Для листування: [email protected]

Відредаговано Джеффрі М. Фрідманом, Університет Рокфеллера, Нью-Йорк, Нью-Йорк, та затверджено 12 травня 2006 р. (Отримано на огляд 29 серпня 2005 р.)

Анотація

Білковий гормон лептин - це цитокін I типу, що виділяється адипоцитами, який діє на ЦНС для регулювання споживання їжі та метаболізму (1, 2). На додаток до регулювання маси тіла, лептин впливає на розмноження, ріст, реакції на стрес та функцію щитовидної залози (3, 4). Дії лептину бувають як гострими, так і хронічними. Наприклад, постпрандіальне збільшення плазмового лептину пригнічує споживання їжі, тоді як середньодобові концентрації лептину в плазмі повідомляють мозок про довгостроковий енергетичний статус (5). Ці дії опосередковуються мембранними рецепторами лептину (LR), з яких у ссавців виявлено шість ізоформ (6). Зв’язування лептину з довгою формою LR (LRb) активує перетворювач сигналу кінази 2/сигналу Януса та активатор сигнального шляху транскрипції 3 (STAT-3) (7), який опосередковує вплив лептину на споживання їжі, метаболізм глюкози та збільшення ваги але не впливає на фертильність (8).

Зростаюча поширеність ожиріння та метаболічних розладів у людини (9) зосередила дослідження на фізіологічній ролі лептину в енергетичному балансі та споживанні їжі у дорослих ссавців. Нещодавно зв’язок між вагою при народженні та порушеннями обміну речовин у дорослих (10) звернув увагу на можливі взаємозв’язки лептину, росту та розвитку на стадіях плоду. Циркулюючий лептин підвищений у плоді людини під час пізньої вагітності та корелює з масою жиру та вагою при народженні (11, 12). У плодової миші лептин і LR експресуються в печінці, серці, волосяних фолікулах і первинній кістці до утворення жирової тканини (13, 14), а лептин міститься в циркуляції плодових овець (15). Хоча ці моделі вираження свідчать про роль лептину в плоді, про функції лептину в ранньому розвитку відомо мало.

У цій статті ми повідомляємо про молекулярне клонування жаб-гомологів генів ob та ob рецепторів (obr) ссавців та функціональну характеристику білкових продуктів цих генів у неанамнітових хребетних. Лептин і LR жаби (що відповідає LRb ссавців) експресуються протягом ембріогенезу та розвитку пуголовків і широко експресуються у неповнолітніх жаб. Внутрішньоцеребровентрикулярна ін’єкція рекомбінантного лептину жаби (rxLeptin) чинила потужний анорексигенний ефект у середньометаморфному пуголовку та юнацькій жабі, але не в ранньому прометаморфному пуголовку. LR експресується в задній кінцівці ранніх прометаморфних пуголовків, а лікування rxLepptin індукує ріст задніх кінцівок та формування цифр in vivo та стимулює поглинання [3 H] тимідину in vitro. Таким чином, крім своєї невід’ємної ролі регулятора апетиту та енергетичного балансу, лептин може також виконувати нові функції фактора росту під час раннього розвитку.

Результати

Молекулярне клонування генів жаб ob і obr.

Ми виділили та секвенували область кодування гена Xenopus laevis ob разом із повними 5 ′ UTR та ≈600 bp 3 ′ UTR. Прогнозований 16,9-кДа білковий продукт гена жаби ob має 21-аа сигнальний пептид і 148-аа зрілий пептид. Ген лептину жаби має три екзони та два інтрони, з кодуючою послідовністю в екзонах 2 і 3, подібно до геномної структури ob генів ссавців (рис. 1 А). Жабковий лептин на 35% схожий на людський, 34% схожий на курячий, але лише на 13% схожий на передбачуваний лептин з бубликів (посилання 16; рис. 1 Б). Прогнозовані третинні структури лептинів жаб, щурів та риболовних рибок, отримані за алгоритмом SWISS – MODEL (17), є дуже консервативними, незважаючи на значну розбіжність у первинних структурах серед видів (рис. 1 С).

Молекулярна характеристика лептину жаби. (А) Прогнозована геномна структура гена жаби ob зберігається у людини. Темне затінення показує області кодування. (B) Вирівнювання амінокислот хребетних лептинів. Стрілки показують збережені цистеїни. Номер приєднання GenBank є такими: X. laevis, AY884210; людина, NP000221; щур, BAA08296; курка, AF012727; рибка-пуфер (Tetraodon), AB193549. (C) Стрічкові діаграми прогнозованих третинних структур лептинів X. laevis, щурів та риболовлі (автоматизований сервер моделювання гомології білків SWISS – MODEL; заснований на файлі структури банку даних лептину людського лептину 1AX8.pdb).

Ми також виділили кДНК у повний зріст, що відповідає передбачуваному гену obr, із легені Xenopus tropicalis. Прогнозований ген frog obr (рис. 2 А) охоплює 87,3 кб геномної ДНК і складається з 26 екзонів, 8 екзонів 5 ′ UTR (826 bp) та 18 екзонів кодуючої послідовності (3436 bp; 1145 aa) та часткового 3 ′ UTR (129 bp). Прогнозований білок LR жаби на 37,5% ідентичний LR людини; схожість послідовностей найбільша у домені зв'язування ліганду та навколо нього, трансмембранній області та внутрішньоклітинній С-кінцевій області (див. супровідну інформацію, опубліковану на веб-сайті PNAS). Ця послідовність включає термінальний 922-bp екзон, який відповідає розширеному кінцевому екзону ссавців, який кодує С-кінцевий внутрішньоклітинний домен довгої форми LR. У ссавців два залишки тирозину (Tyr-985 та Tyr-1138 у миші) в межах цього екзону мають важливе значення для внутрішньоклітинної передачі сигналів (7), і ці залишки зберігаються в жабі obr (див. Супровідну інформацію). Алгоритм ProDom (18) підтвердив, що ця послідовність кДНК є жабчим гомологом генів obr ссавців (при P signalp 3.0 (20) передбачається сигнальний пептид у перших 21 bp кодуючої послідовності, який за розміром дорівнює сигнальному пептиду людського ЛР.

Експресія мРНК лептину та LR у жаби. (А) Розподіл тканин у неповнолітніх жаб лептину та мРНК LR аналізували за допомогою кількісної RT-PCR (див. Методи). Рівні лептину та LR мРНК нормалізувались до експресії гена рибосомного білка L8 (rpL8). (B) Експресія розвитку лептину мРНК у X. laevis аналізувалась за допомогою напівкількісної RT-PCR (див. Методи).

Аналізи споживання їжі.

Ефекти i.c.v. ін'єкція rxLeptin на час, витрачений на корм у ранніх прометаморфних або середньометаморфних пуголовках S. hammondii та на розмір їжі у неповнолітніх X. laevis. Букви вказують на попарні відмінності Дункана між лікуваннями (P 3 H] Поглинання тимідину in vitro.