Недоїдання, новий індуктор для кальцифікації артерій у хворих на гемодіалізі
Анотація
Передумови
Артеріальна кальцифікація є важливим фактором серцево-судинного ризику у хворих на гемодіалізі. У процесі кальцифікації артерій бере участь ряд факторів; однак взаємозв'язок між недоїданням та кальцифікацією артерій досі незрозумілий.
Методи
У це дослідження було включено 68 хворих на гемодіаліз. Статус харчування оцінювали за допомогою модифікованої кількісної суб'єктивної глобальної оцінки (MQSGA). Вимірювали відповідні біохімічні параметри сироватки. А зразки променевої артерії були зібрані під час операцій на артеріовенозних фістулах. Гематоксилін/еозинові плями використовували для спостереження за артеріальними структурами, тоді як червоне пляма алізарину для спостереження кальцинованих відкладень та класифікації ступеня звапнення. Експресії кісткового морфогенетичного білка 2 (BMP2) та матричного білка Gla (MGP) були виявлені за допомогою імуногістохімії та вестерн-блот-методів.
Результати
66,18% пацієнтів на гемодіалізі страждали від недоїдання. У хворих на гемодіаліз кальциновані відкладення головним чином розташовувались у медіальному шарі променевих артерій, а вираження BMP2 та MGP були збільшені в кальцифікованих зонах. Рівні сироваткового альбуміну негативно асоціювались з показником кальцифікації та експресією BMP2 та MGP. У той час як показник MQSGA, сироватковий фосфор та кальцій × фосфорний продукт показав позитивні зв’язки з показником кальцифікації та вираженнями BMP2 та MGP.
Висновки
Гіпотрофія переважає у хворих на гемодіаліз і пов’язана з кальцифікацією артерій та вираженнями BMP2 та MGP у кальцифікованих променевих артеріях. Гіпотрофія може бути новим кандидатом на індуктор для кальцифікації артерій у хворих на гемодіалізі.
Передумови
Артеріальна кальцифікація є основним фактором ризику серцево-судинної смертності, особливо для хворих на гемодіалізі [1]. Це підвищує жорсткість артерій, швидкість пульсових хвиль, зменшує артеріальну комплаєнс і в кінцевому підсумку призводить до серйозних серцево-судинних подій [2, 3].
Традиційно кальцифікація артерій вважається пасивним процесом; однак нещодавні дослідження показали, що кальцифікація артерій є активно регульованим процесом, і в цей процес бере участь ряд факторів [4]. Кістковий морфогенетичний білок 2 (BMP2) і матричний білок Gla (MGP) - це два тісно пов’язані критично важливі білки, які регулюють кальцифікацію артерій [5]. І встановлено, що BMP2 є промотором артеріальної кальцифікації, тоді як MGP вважається інгібітором артеріальної кальцифікації [6, 7]. Однак досі незрозуміло, який ключовий фактор пов'язаний з поширеністю артеріальної кальцифікації та експресією BMP2 та MGP при кінцевій стадії ниркової хвороби (ESRD).
Гіпотрофія також є ключовим фактором, пов’язаним із збільшенням захворюваності та смертності хворих на гемодіалізі [8]. Однак чи бере участь гіпотрофія в процесі кальцифікації артерій та чи пов’язує це з виразами BMP2 та MGP, недостатньо зрозуміло. У цьому дослідженні ми оцінили стан харчування хворих на гемодіалізі та дослідили роль гіпотрофії у процесі кальцифікації артерій.
Матеріали і методи
Пацієнти
Збір даних про демографічні характеристики та оцінка стану поживності
Демографічні характеристичні дані збирали таким чином: стать, вік, зріст, вага, первинні захворювання, ускладнення та тривалість гемодіалізу.
Модифікована кількісна суб’єктивна глобальна оцінка (MQSGA), хороший метод оцінки стану поживності, була спеціально використана для пацієнтів із ШОЕ. У цьому дослідженні ми використовували MQSGA для оцінки стану харчування хворих на гемодіаліз. MQSGA складається із семи компонентів: зміни ваги, шлунково-кишкові симптоми, вживання їжі, функціональна здатність, супутня захворюваність, підшкірний жир та ознаки втрати м’язів. Кожен компонент має оцінку від 1 (нормальний) до 5 (дуже важкий). «Оцінка недоїдання» - це цифра від 7 (норма) до 35 (тяжке недоїдання) [9]. На основі оцінки MQSGA було класифіковано дві групи: група нормального харчування (оцінка 7–10) та група недоїдання (оцінка 11–35).
Збір біохімічних даних
Перед операцією зразки крові збирали у пробірки, що містять етилендіамінтетраоцтову кислоту (ЕДТА), а потім зберігали при -20 ° С перед аналізом. Кальцій у сироватці крові, фосфор у сироватці крові, альбумін, тригліцериди, загальний холестерин (TG), холестерин ліпопротеїдів низької щільності (LDL-c) та холестерин ліпопротеїдів високої щільності (HDL-c) вимірювали за допомогою автоаналізатора TBA-120 (Toshiba Medical Systems, Японія).
Рівні інтактного паратиреоїдного гормону (ПТГ) у сироватці крові оцінювали методом хемілюмінесценції (Immulyte 2000; DPC, Лос-Анджелес, Каліфорнія). Кальцій × фосфор (Ca × P) розраховували на основі кальцію та фосфору в сироватці крові. Кальцій у сироватці крові 1 ммоль/л = 4 мг/дл, фосфор у сироватці крові 1 ммоль/л = 3,1 мг/дл, коригований рівень кальцію в сироватці (мг/дл): кальцикульт у сироватці крові + 0,8 × [4-sAlb (сироватковий альбумін) (г/дл )]].
Гістологічний аналіз
У хворих під час операцій на артеріовенозних фістулах вирізали окружний відрізок променевої артерії розміром 2–3 мм і негайно помістили у фізіологічний розчин. Зразки розтинали без жиру та підшкірно, фіксували на ніч у 4% параформальдегіді, а потім вносили у парафін. Зрізи тканин товщиною 4 мкм готували і фарбували гематоксиліном/еозином (ВІН, Інститут біології Бейотіме, Сучжоу, Китай). І алізарин червоний (Genmed Scientifics Inc., США).
ВІН пляма
Від 3 до 5 зрізів на зразок депарафінізували та гідратували у воду. Ядра фарбують гематоксиліном протягом 10 хвилин. Потім промити в проточній водопровідній воді протягом 10 хвилин. Після зневоднення 5 секунд у 95% спирті зрізи фарбували еозином від 30 секунд до 2 хвилин залежно від віку еозину та бажаної глибини зустрічного плями. Зневоднюють у 95% спиртах 2 хвилини і повторюють один раз, щоб видалити надлишок еозину. Під мікроскопом ми могли бачити, як ядра забарвлювались у синій колір, а цитоплазма - у рожевий.
Алізаринова червона пляма
Червоне пляма алізарину - це PH-залежний метод диференціації оксалату кальцію від карбонату кальцію та фосфату. Від 3 до 5 зрізів на зразок депарафінізували та гідратували до дистильованої води. Забруднюйте предметне скло розчином червоного алізарину близько 2 хвилин. Струсіть надлишки барвників і протріть зрізи. Зневоднюють у ацетоні, а потім у розчині ацетон-ксилолу (1: 1). Очистіть у ксилолі та встановіть у синтетичному монтажному середовищі. Під мікроскопом ми бачили, як відкладення кальцію (крім оксалату) були пофарбовані в оранжево-червоний колір.
Гістологічна оцінка кальцифікації
Гістологічний показник кальцифікації був отриманий шляхом усереднення всіх балів з усіх зрізів червоного плями алізарину та оцінки від 0 до 4 [10]. Оцінка 2,5-4 = сильний кальцинат. Згідно з оцінкою червоних плям Алізарину, ми класифікували пацієнтів на три групи: група не кальцинована (NC), група слабо кальцифікована (SLC) та група важких кальцифікованих (SEC).
Імуногістохімічне пляма
Від 3 до 5 незабарвлених предметних стекол кожного зрізу тканини депарафінізували в ксилолі та регідратували у спадному ахолі. Потім предметні стекла поміщали в 3% перекис водню для інгібування ендогенної пероксидази. Після промивання сольовим розчином Tris зрізи блокували 3% бичачим сироватковим альбуміном (Sigma-Aldrich Tradign Co, Ltd) протягом 15 хвилин, а потім інкубували з первинним антитілом у відповідних розведеннях протягом ночі. Використаними антитілами були: BMP2 (1: 100, Abcam) і MGP (1: 100, Santa Cruz Biotechnology). Фарбування без первинного антитіла, розрізаного як негативний контроль. Другу кон'юговану з пероксидом антитіла козу-анти-мишу (Вейцзя, Гуанчжоу, Китай) при розведенні 1: 400 застосовували протягом 45 хвилин, розробляли разом з DAB (Вейцзя, Гуанчжоу, Китай), а зрізи фарбували Гаррісом Гематоксиліном (Вейцзя, Гуанчжоу, Китай).