Shp2 контролює вагу тіла жінки та енергетичний баланс, інтегруючи сигнали лептину та естрогену
АНОТАЦІЯ
ВСТУП
У ссавців лептин регулює споживання їжі та енергетичний баланс, головним чином, через активацію довгої форми рецептора лептину (LepRb) та сигнальних шляхів у гіпоталамусі, а дефіцит лептину спричинює ожиріння та діабет, а також порушує репродуктивні функції (14, 15, 31) . Було показано, що SH2-тирозинфосфатаза Shp2 зв’язується безпосередньо з активованим LepRb шляхом стикування на p-Tyr985 у внутрішньоклітинному домені (23, 37). Генетична абляція Shp2 в центральній нервовій системі призвела до грубого ожиріння, асоційованого з резистентністю до лептину, і зниженням p-Erk, що свідчить про позитивну роль Shp2 в посиленні сигналу лептину в гіпоталамусі (2, 22, 37).
Естрадіол-17β (Е2), репродуктивний гормон, також відіграє важливу роль в енергетичному обміні та контролі маси тіла (13). Видалення ароматази, яка каталізує утворення естрогену або порушення рецептора естрогену α (ERα), призводить до більш важкого вікового ожиріння у жінок, ніж у чоловіків, що вказує на те, що дефіцит естрогену відповідає за прогресування сексуально диморфного ожиріння (19, 21 ). У жінок у постменопаузі або гризунів з яєчником дефіцит естрогену пов’язаний із збільшенням ймовірності ожиріння та діабету 2 типу (7, 32). Заміна естрогену у оваріектомізованих тварин пригнічує розвиток ожиріння, зменшуючи споживання їжі та збільшуючи витрати енергії (17). Гормональне лікування у жінок у постменопаузі запобігає прогресуванню ожиріння та підвищує чутливість до інсуліну та толерантність до глюкози (33). Навпаки, делеція або замовчування ERα в гіпоталамусі призводить до ожиріння та метаболічних дефектів у гризунів (19, 25). Естроген має лептиноподібний ефект при активації внутрішньоклітинних сигналів у клітинах меланокортину гіпоталамусу (16). Однак залишається визначити, як сигналізація естрогену переплітається з лептиновим шляхом.
Позитивна роль Shp2 у опосередкуванні сигналу лептину в мозку передбачала, що фармацевтичне посилення активності Shp2 локально в мозку подолає стійкість до лептину та полегшить ожиріння. Щоб перевірити цю гіпотезу, ми створили трансгенну лінію миші з експресією в нейронах переднього мозку домінантно активуючого (посилення функції) мутанта Shp2 D61A, який, як було показано, демонструє різко підвищену активність фосфатази, не впливаючи на її SH2-зв'язуючу активність (26) . Характеристика трансгенних мишей виявила несподівано критичну роль Shp2 у зв'язуванні сигналів лептину та естрогену. Ці дані заповнюють прогалину в наших знаннях про перекриття функції цих двох гормонів у метаболізмі та допомагають показати, чому жінки в постменопаузі схильні до ожиріння.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Покоління трансгенних мишей Shp2 D61A. Мутант Shp2 D61A був створений шляхом сайт-спрямованого мутагенезу з використанням кДНК миші Shp2 як шаблону. Мутантний фрагмент Shp2 D61A з послідовністю міток гемаглютиніну (HA) на кінці С субклонований у вектор pcDNA3.1. Промотор цитомегаловірусу (CMV) у плазміді pcDNA3.1 був замінений на промотор CaMKIIα (12) для стимулювання експресії мутанта Shp2 D61A -HA. Сконструйована конструкція була введена в запліднені ооцити мишей C57BL/6 для отримання трансгенної лінії миші у тваринницькому інституті Санфордського/Бернхемського медичного дослідницького інституту (SBMRI). Усі процедури на тваринах були схвалені Каліфорнійським університетом, Сан-Дієго, та інституційними комітетами з догляду та використання тварин SBMRI.
Ін’єкція AAV. Систему експресії аденоасоційованого вірусу (AAV) (Stratagene) використовували для отримання AAV-зеленого флуоресцентного білка (GFP) та вірусу AAV-Shp2 D61A -GFP. Віруси AAV вводили в медіобазальний гіпоталамус мишей, як описано раніше (38). Коротко кажучи, двостороння ін'єкція в медіобазальний гіпоталамус була спрямована за допомогою ультраточного стереотакса з роздільною здатністю 10 мкм (Kopf Instruments) до координат 1,5 мм позаду брегми, 5,8 мм нижче брегми та 0,3 мм латерально від середньої лінії. Віруси, суспендовані в спинномозковій рідині, вводили протягом 10 хв через направляючу канюлю 26 калібру та інжектор 33 калібру (Plastics One), підключені до шприца Гамільтона та інфузійного насоса (WPI Instruments).
Харчування HFD та оваріектомія. Мишей дикого типу (мас.) Та трансгенних у віці від 8 до 10 тижнів годували або дієтою з високим вмістом жиру 58% ккал (HFD; номер каталогу D12331; Дієти досліджень), або дієтою чау з 6% ккал (номер каталогу 8664; Харлан Теклад) протягом 20 тижнів (24). Вага тіла мишей контролювали щотижня. Щоб виміряти споживання їжі, мишей розділяли в окремі клітки, і зміни в кількості їжі реєстрували щодня. Оваріектомію проводили на масових і трансгенних самках мишей у віці від 10 до 12 тижнів. Через 1 тиждень після операції мишей годували або HFD, або регулярною чау-дієтою протягом 8 тижнів, а вагу їх тіла контролювали щотижнево.
Метаболічні аналізи. Рівні інсуліну та лептину в сироватці крові вимірювали за допомогою комерційних наборів (каталожний номер 90030 та каталожний номер INSKR020; Crystal Chem). Естрадіол (Cayman), тестостерон (Cayman) та кортикостерон (Enzo Life Science) вимірювали за допомогою імуноферментного аналізу. Тест на толерантність до інсуліну (ITT) та тест на толерантність до глюкози (GTT) проводили на мишах Shp2 D61A та масою тіла у віці від 24 до 26 тижнів після годування HFD протягом 16 до 18 тижнів. Для ІТТ інсулін (Humulin R; Eli Lilly) вводили внутрішньочеревно (1 ОД/кг [маса тіла]), а рівень глюкози в крові вимірювали глюкометром (Lifescan One-Touch Basic) при 0, 15, 30, 60 та 120 хв. Для GTT тваринам голодували протягом 12-16 годин і вводили глюкозу (1,5 г/кг [маса тіла]), а потім вимірювали рівень глюкози в крові через 0, 15, 30, 60 та 120 хв.
Для чутливості до лептину мишам, яких годували HFD або дієтою чау протягом 16 тижнів, інтраперитонеально вводили лептин (1,5 мкг/кг [маса тіла]; Національна програма з гормонів і пептидів) двічі на день протягом 3 днів (7:30 ранку та 6:30 вечора; доза 1,5 мкг/кг [маса тіла]) (24). Мишей розділили в окремі клітини і помістили на дієту чау. Вагу тіла та споживання їжі контролювали щодня протягом 7 днів. Споживання O2 та вироблення CO2 вимірювали за допомогою системи Oxymax (Columbus Instruments).
Дослідження клітинної сигналізації. Миші у віці 30 тижнів, яких годували HFD протягом 20 тижнів, голодували протягом 12-16 годин. Лептин (1,5 мкг/кг [маса тіла]), естрадіол-17β (каталог № 3301 [Calbiochem], 50 мкМ/кг [маса тіла]) та фізіологічний розчин вводили внутрішньочеревно за 1 год до жертви. Мозок ретельно виділяли і гомогенізували буфером для лізису тканин, а потім лізат двічі центрифугували при 14000 об/хв протягом 30 хв. Лізати, що містять 50 мкг білка, імуноблотували для pY-Stat3 (каталог No 9131; Cell Signaling), Stat3 (каталог No 9132; Cell Signaling), pAkt-s473 (каталог No 9271; Cell Signaling), pAkt-t308 ( Каталожний номер 9275; Клітинна сигналізація), Akt (Каталожний № 9272; Клітинна сигналізація), pY-Src і Src (Клітинна сигналізація), pErk1/2 (Каталожний № 9101; Клітинна сигналізація), адипонектин (Мілліпор) та HA (Оновлення). Мозок миші був виділений після перфузії 4% параформальдегідом (PFA) для замороженого зрізу. Антитіло Shp2 (syp саморобне або sc-280; Біотехнологія Санта-Крус), антитіло ERα (sc-542; Біотехнологія Санта-Крус) та антитіло pY-Stat3 використовували для імунозабарвлення. Печінку збирали для замороженого зрізу, а потім фарбували O-червоним маслом або гематоксиліном та еозином (H&E) (4). Жирову тканину фіксували розчином Z-Fix протягом 24 годин для фарбування H&E. Зразки мозку збирали для замороженого зрізу та фарбували антитілами.