Drosophila melanogaster як функціональна високоефективна скринінгова модель антинефролітіазу
АНОТАЦІЯ
ВСТУП
Нефролітіаз (камені в нирках) є загальним урологічним розладом, що вражає 10% населення в промислово розвинутих країнах (Лопес та Хоппе, 2010; Ромеро та ін., 2010). У США поширеність кам’яної хвороби зросла з 5,2% (1994) до 8,4% (2012) (Scales et al., 2012). У всьому світі частота та поширеність нефролітіазу демонструє подібну тенденцію та суттєво сприяє розвитку хронічної хвороби нирок (ХХН) (El-Zoghby et al., 2012; Romero et al., 2010). Економічне навантаження на нефролітіаз є значним, і лише в США щорічні витрати становлять 5,3 млрд доларів (Ковшиловська та ін., 2012). Незважаючи на значні витрати та захворюваність на нефролітіаз, коли 5-річна частота рецидивів наближається до 50% у постраждалих осіб, повного розуміння нефролітіазу на молекулярному рівні все ще бракує (Katsuma et al., 2002; Lotan et al., 2004). Патогенез нефролітіазу оксалату кальцію, найпоширеніший підтип каменю (80%), є багатофакторним (Finkielstein, 2006). Сприятливими факторами є порушення обміну речовин, такі як гіперкалькурія, гіпероксалурія або гіпоцитратурія, а також фактори навколишнього середовища, такі як дієта. Ці етіологічні елементи порушують метастабільний біохімічний гомеостаз сечі, що в кінцевому підсумку завершується відкладенням кристалів і каменеутворенням (Пак, 1998).
Стратегії профілактики медикаментозного лікування нефролітіазу оксалату кальцію, які з середини 1980-х років залишаються відносно нерухомими, різняться залежно від основної етіології. Сучасні дані свідчать про те, що цитрат калію та тіазидні діуретики є ефективними засобами у профілактиці утворення каменів оксалату кальцію при станах гіпоцитратурії та гіперкалькурії (Qaseem et al., 2014; Reilly et al., 2010). На відміну від них, при первинній та ідіопатичній гіпероксалурії, пропорційно важливих джерелах утворення каменів оксалату кальцію, доказів є недостатньо стабільно ефективним медичним лікуванням. Раніше піридоксин пропонувався на основі кількох невеликих нерандомізованих клінічних випробувань (Balcke et al., 1983; Mitwalli et al., 1988; Rattan et al., 1994). Новіші підходи, такі як лікування пробіотиками та оксалатдекарбоксилазою, дали неоднозначні результати (Moe et al., 2011; Xu et al., 2013).
Можливо, прогрес був обмежений через відсутність відповідних доклінічних моделей, які б надійно повторювали патофізіологію цього розладу. Раніше для вивчення нефролітіазу було створено кілька моделей на тваринах, включаючи моделі на щурах, мишах, свинях та собаках (Khan, 1997). Історично найбільш відомим серед них була щуряча модель нефролітіазу. Модель щурів покладається на дієтичні маніпуляції або внутрішньоочеревинну ін’єкцію літогенних агентів (етиленгліколь, хлорид амонію або вітамін D3) для стимулювання утворення зубного каменю (Khan, 1997; Liu et al., 2007). Використання цієї моделі призвело до змінних результатів із непослідовним каменеутворенням. Крім того, нефротоксичність літогенних агентів обмежує загальну корисність моделі (Khan and Glenton, 2010; Khan et al., 2006).
З цим відкриттям ми розробили нові методи візуалізації для візуалізації та кількісної оцінки навантаження каменю оксалату кальцію на моделі дрозофіли нефролітіазу оксалату кальцію. Це призвело до розробки функціональної високопродуктивної скринінгової платформи, що дозволяє нам проводити скринінг хімічних бібліотек для виявлення нових сполук, які проявляють антилітогенну активність in vivo та є ковтальними. Хоча ця модель не повністю рекапітулює процеси утворення конкрементів ссавців, ми успішно виявили сполуки, які були високоефективними у зупинці утворення зубного каменю. Гідрохінон β-D-глюкопіранозид, широко відомий як арбутин, є глікозидом з гідроксихіноновими (HQ) фрагментами, найчастіше виділеними з Arctostaphylos uva-ursi або куща карликового дерева Bearberry (Pop et al., 2009). Було виявлено, що арбутин пов'язує як вільні іони кальцію, так і оксалат, слугуючи подвійним антагоністом кристалізації оксалату кальцію. Це відкриття показало, що інші нові антилітогенні сполуки можуть бути виявлені подібним чином завдяки переважно безклітинному розвитку каменів у нирках.
РЕЗУЛЬТАТИ
Бісфосфонатні зонди зв'язуються з конкрементами оксалату кальцію, утвореними дрозофілою
Формування конкрементів оксалату кальцію у D. melanogaster. (А) Конфокальні та двозаломлюючі зображення порошкоподібних кристалів оксалату кальцію людини (верхній ряд) та синтетичних частинок гідроксиапатиту (нижній ряд), забарвлених зондом-алендронат-FITC. Ваги: 1 мм. (B) Схема моделі утворення конкрементів оксалату кальцію D. melanogaster у мальпігівських канальцях (MTs). (C) Інтравітальне візуалізація сигналу подвійного заломлення, що представляє конкременти на основі оксалатів в межах MT личинок D. melanogaster. Інтравітальне зображення личинок D. melanogaster, що несуть кальцій-оксалат-камінь, що спричиняє дієту, що експресує RFP. Стрілка вказує RFP + MT із двопроменезаломлюючим сигналом (C, знизу). Ваги: 1 мм. (D) Розсічені МТ виявляють наявність алендронат-FITC-позитивних відкладень (стрілки) у RFP + МТ, що підтверджує присутність конкрементів на основі оксалатів. Стрижні шкали: 25 мкм. (E) Розсічені МТ, як зображено за допомогою яскравого поля або скануючої електронної мікроскопії (SEM). Пунктирна стрілка представляє мухоподібні канальці та кишковий комплекс. Суцільна стрілка показує числення МТ. (F) SEM/енергетично-дисперсійний рентгенівський аналіз (EDX) аналіз моногідратного кальцію оксалату кальцію, вилученого з МТ. Шкала шкали: 3 мкм. (G) SEM/EDX аналіз кальцію оксилату дегідрату кальцію, вилученого з МТ. Шкала шкали: 3 мкм.