DSCAM-AS1 сприяє зростанню пухлини раку молочної залози за рахунок зменшення miR-204-5p та регуляції RRM2

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Запис ORCID для Na Li
Для листування: [email protected]

Анотація

Короткий виклад Для визначення експресії DSCAM-AS1 та miR-204-5p при БК використовували аналіз мікрочипів та qRT-PCR. DSCAM-AS1 сприяв проліферації та порушенню апоптозу клітин ВС шляхом зменшення miR-204-5p та посилення експресії RRM2.

Вступ

Рак молочної залози (РМЗ) є поширеною злоякісною пухлиною у всьому світі, і щорічно понад 370 000 жінок помирають через БЦ в усьому світі щорічно (Wang et al., 2017). Основною причиною захворюваності та смертності від BC є невиліковна метастатична хвороба, яка має високу стійкість до традиційної терапії (Xu et al., 2017). Незважаючи на досягнення в діагностиці та терапії, такі як хірургічне втручання, хіміотерапія та опромінення, серед пацієнтів з БК є високі показники рецидивів та метастазування (Wang et al., 2015). Крім того, безперервне лікування променевою та хіміотерапією призводить до менш ефективного знищення ракових клітин через набуту резистентність (Vimalraj et al., 2013). Тому молекулярні механізми, що лежать в основі пухлинного генезу БЦ, потребують подальшого дослідження.

Довгі некодуючі РНК (lncRNAs) визначаються як транскрипти, що мають понад 200 нуклеотидів і не мають здатності кодувати білок (Xu et al., 2017). Повідомляється, що LncRNA беруть участь у прогресуванні пухлини та метастазуванні шляхом регулювання біологічних процесів різних рівнів, таких як альтернативне сплайсинг мРНК, білкова активність, зміни локалізації білка тощо (Huarte, 2015; Xu et al., 2017). Зростаюча кількість літератур повідомляє, що lncRNAs тісно пов'язані з раком людини і беруть участь у контролі доступності для конкретних miRNAs (Bartonicek et al., 2016). У БК повідомлялося про ряд диференційовано експресованих lncRNA та їх кореляцію з пухлинними функціями (Xi et al., 2017; Yan et al., 2017; Zhou et al., 2017). Наприклад, lncFOXO1 помітно регулювався в BC і пригнічував ріст BC завдяки збільшенню транскрипції FOXO1 (Xi et al., 2017). У той час як Linc-ITGB1 сильно регулювався в БК, що сприяло метастазуванню клітин (Yan et al., 2017).

Антисмислова lncRNA DSCAM (молекула клітинної адгезії синдрому Дауна) (DSCAM-AS1), розташована на 21q22.2, транскрибується з антисмислової ланцюга DSCAM, що належить до сімейства імуноглобулінів клітинних молекул адгезії (Zhao et al., 2014). Кілька літератур повідомляють, що DSCAM-AS1 асоціюється з прогресуванням ракових клітин (Miano et al., 2016; Niknafs et al., 2016; Zhao et al., 2014). Чжао та ін. встановили, що DSCAM-AS1 надмірно експресується в аденокарциномі легенів і може взаємодіяти з їх генами-господарями для виконання функції різних підтипів раку легенів (Zhao et al., 2014). Міано та ін. виявили, що надмірна експресія DSCAM-AS1 сприяла зростанню просвітньої клітинної лінії раку молочної залози (Miano et al., 2016). Варто зазначити, Яшар С та співавт. показали, що DSCAM-AS1 може взаємодіяти з hnRNPL для опосередкування прогресування пухлини (Niknafs et al., 2016). Однак вся історія про те, як DSCAM-AS1 опосередкований ріст і прогресування раку молочної залози в основному залишається незвіданим. Тому необхідне подальше розуміння цілей та мереж, регульованих DSCAM-AS1.

Рибонуклеотидредуктаза М2 (RRM2) є каталітичною субодиницею рибонуклеотидредуктази, яка є важливим ферментом, що бере участь у синтезі ДНК, і може регулювати його ферментативну активність (Iwamoto et al., 2015). У кількох публікаціях повідомляється, що RRM2 був надмірно експресованим у різних ракових клітинах (Zhong et al., 2016). Порушення регуляції RRM2 у БК раніше досліджувалося в деяких літературах. Наприклад, RRM2 регулювався в клітинах BC і міг виступати критичним маркером для агресивного BC (Lu et al., 2012). Шах та ін. встановили, що інгібування RRM2 пригнічує ріст пухлини in vivo та зменшує міграцію та інвазивність клітин при БК (Putluri et al., 2014). Кілька досліджень вказували на роль RRM2 як мішені miRNA при раку людини. Результати наших експериментів пояснили механізм регулювання між RRM2 та miR-204-5p.

У поточному дослідженні ми вимірювали рівень експресії DSCAM-AS1 та miR-204-5p у клітинах BC. Згодом ми застосували репортерну систему з подвійною люциферазою, щоб перевірити кореляцію DSCAM-AS1 та miR-204-5p. Потім ефекти DSCAM-AS1 на проліферацію ВЦ, метастази росту та апоптоз вимірювали за допомогою серії експериментів in vitro, включаючи аналіз апоптозу клітин, аналіз CCK-8 та аналіз трансульверу та експерименти in vivo. Крім того, ми також дослідили вплив RRM2 на активність клітин ВС та ріст пухлини. Ці результати підкреслили, що DSCAM-AS1 може бути перспективною терапевтичною стратегією для лікування БК людини.

Матеріали і методи

Зразки тканин

Тканини BC та прилеглі тканини були зібрані у період з січня 2014 р. По серпень 2015 р. У 40 пацієнтів лікарні Приєднаного центру медичного університету Сіньсян. Усі зразки були зібрані у жінок у віці 44-71 років (середній вік: 62,3). До операції пацієнти не отримували жодної хіміотерапії та променевої терапії. Всі зразки тканин були незалежно перевірені трьома патологоанатомами або лікарями перед консервуванням у рідкому азоті при -80 ° C або перенесенням у мікроцентрифужні пробірки, що містять реагент TRIzol, для вилучення РНК. Відповідні характеристики цих 40 пацієнтів описані в таблиці 1. Усі експерименти проводились за інформованою згодою пацієнтів та за погодженням з лікарнею приєднаного центру медичного університету Сіньсян.

Клініко-патологічна характеристика досліджуваних

Культура клітин

Клітинна лінія раку молочної залози людини HCC1937 та лінія клітин ембріональної нирки людини HEK293 були придбані у банку клітин Академії наук Китаю (Шанхай, Китай). Клітини HCC1937 культивували в середовищі RPMI-1640 (GIBCO, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) плюс 10% (об/об) фетальної бичачої сироватки (FBS), 1,5 г/л NaHCO3, 2,5 г/л глюкози, 0,11 г/Л пірувату натрію та 1% (об./Об.) Пеніцилін-стрептоміцину. Клітини HEK293 підтримували в середовищі DMEM з додаванням 10% (об/об) FBS І 1% (об/об) пеніциліну-стрептоміцину.

Аналіз мікрочипів

Дані про тканини пухлини молочної залози були зібрані з бази даних TCGA. R-пакет 'DESeq2' був використаний для нормалізації, ідентифікації та візуалізації диференційовано експресованих міРНК та lncRNA (log2 | Fold Change |> 1 та метод P.adjust - ΔΔCt був використаний для кількісної оцінки відносних значень експресії мРНК. в таблиці 2.

Послідовності праймерів для qRT-PCR

Вестерн-блот

Зразки білка лізували в буфері RIPA (Beyotime, Шанхай, Китай) з коктейлем інгібітора протеази (Roche, Базель, Швейцарія). Після центрифугування концентрацію супернатанту білка вимірювали за допомогою реагенту Бредфорда (Bio-Rad, Каліфорнія, США). Після елюювання SDS-завантажувальним буфером білки електрофорезували в 10% гелі електрофорезу в SDS-поліакриламідному гелі (SDS-PAGE), переносили в нітроцелюлозні мембрани (Millipore, США) і блокували. Додавали первинні антитіла (анти-RRM2, ab172476, 1: 2000; анти-GAPDH, ab181603, 1: 10000, Abcam, Кембридж, Массачусетс, США). Після екстенсивного промивання TBST додавали вторинне антитіло (Goat anti-Rabbit IgG H&L (HRP), ab6721, 1: 2000, Abcam, Cambridge, MA, USA) протягом 1,5 год. Виявлення сигналу проводили шляхом імуноблотингу за допомогою системи ECL (Life Technology, США). Для відносної кількісної оцінки ми нормалізували рівень експресії GADPH (як рівень сірого) до 1 і порівняли рівні експресії (рівень сірого) різних експериментальних груп за допомогою програмного забезпечення ImageJ.