Миро викликає апоптоз і пригнічує проліферацію та міграцію ракових клітин шлунка

Менгсуе Сун, Цзе Хуа, Гаошуан Лю, Пейюн Хуан, Ніншенг Лю, Сяопу Хе; Мірра індукує апоптоз та інгібує проліферацію та міграцію ракових клітин шлунка за допомогою знижуючої експресії циклооксигенази-2. Biosci Rep 29 травня 2020 р .; 40 (5): BSR20192372. doi: https://doi.org/10.1042/BSR20192372

Завантажити файл цитування:

Анотація

Завдання: Це дослідження призначене для оцінки протипухлинних ефектів смири на рак шлунка людини як in vitro, так і in vivo. Методи: Проліферацію клітин раку шлунка визначали методом МТТ. Апоптоз вимірювали за допомогою проточної цитометрії та фарбування Hoechst 33342. Загоєння ран проводили для оцінки впливу смири на міграцію. Експресії COX-2, PCNA, Bcl-2 та Bax були виявлені за допомогою Вестерн-блот-аналізу. Для оцінки протиракового ефекту смири in vivo була встановлена модель оголених мишей-ксенотрансплантатів раку шлунка людини. Результати: Миро суттєво пригнічувало клітинну проліферацію, міграцію та індукований апоптоз in vitro, а також пригнічувало ріст пухлини in vivo. Крім того, смирна пригнічувала експресію PCNA, COX-2 та Bcl-2, а також підвищувала експресію Bax у клітинах раку шлунка. Висновок: Миро може пригнічувати проліферацію та міграцію ракових клітин шлунка, а також індукувати їх апоптоз, знижуючи регуляцію експресії ЦОГ-2.

Вступ

У всьому світі рак шлунка (ГХ) є найбільш діагностованою злоякісною пухлиною та другою провідною причиною смерті, пов’язаної з раком [1,2]. Незважаючи на безліч варіантів лікування, таких як хірургічне втручання, променева терапія, звичайна хіміотерапія, молекулярна, біологічна терапія та цілеспрямована терапія [3,4], прогноз ГХ залишається поганим. Досі необхідні нові методи лікування раку шлунка.

Миро, смолистий ексудат сімейства комміфори [5], давно використовується для лікування запальних захворювань. Численні фармакологічні дослідження досліджували його протизапальні механізми. Гуггулстерон, основний функціональний екстракт мирри, пригнічує ріст пухлини ГХ на тваринних моделях та підвищує хіміочутливість клітин раку молочної залози [6,7]. Крім того, Commiphoramyrrha індукує апоптоз раку передміхурової залози людини та клітин гепатоцелюлярної карциноми [8–10]. Однак ефективність смири при лікуванні ГХ не вивчалась. Це дослідження є першою спробою вивчити вплив смири на морфологію клітин GC

Циклооксигеназа (ЦОГ) є потенційною мішенню в лікуванні та профілактиці пухлин [11]. У ГХ ЦОГ-2 бере участь у пов'язаних з пухлиною процесах, таких як ангіогенез, інвазія та ухилення від імунітету, і вказує на гістологічний підтип, розмір пухлини та стадію розвитку [12]. COX-2 надмірно експресується в клітинах GC людини і пов'язаний із поганою загальною виживаністю [13,14]. Селективні інгібітори циклооксигенази-2 (ЦОГ-2) пригнічують проліферацію та індукують апоптоз клітин GC [15]. У цьому дослідженні дві людські клітинні лінії GC BGC-823 та SGC-7901 були застосовані для оцінки протипухлинного впливу смири на рак шлунка людини. Крім того, були виявлені експресії ЦОГ-2, проліферуючий клітинний ядерний антиген (PCNA) та пов'язані з апоптозом білки для подальшого з'ясування прихованого механізму.

Матеріали і методи

Водний екстракт мірри

Миро (# 71202500) було придбано у лікарні традиційної китайської медицини провінції Цзянсу (Нанкін, Китай). Екстракт мирри готували, як описано раніше [16,17]. Порошкоподібну смолу мірри (1,0 кг) екстрагували достатньою кількістю розчинника (2 × 10 л) тривалістю протягом 1 години. Процес екстракції повторювали двічі. Потім витягнутий розчин кип'ятили у пристрої з конденсаційною температурою зі зворотним холодильником протягом 2 год, природним чином охолоджували до кімнатної температури і центрифугували при 3500 об/хв протягом 20 хв для видалення залишків. Потім надосадову рідину випарювали у роторному випарнику протягом 12 год для отримання порошку мирри. Для приготування відвару з екстрактів мирри 100 мг порошку мирри розчиняли у 5 мл PBS (для експерименту in vivo) або середовища культури клітин (для експерименту in vitro) на водяній бані при 90 ° C – 100 ° C протягом 12 год. Суміш центрифугували при 10000 об/хв протягом 20 хв (двічі) з отриманням супернатанту, пропускали через фільтр 0,22 мкм і зберігали при 4 ° C.

Клітинні лінії та клітинна культура

Погано диференційовані BGC-823 та помірно диференційовані SGC-7901 людські клітинні лінії були отримані від Шанхайського інституту клітинної біології (Шанхай, Китай). Усі клітини регулярно культивували в середовищі RPMI 1640 (BioInd, Ізраїль), доповненій 10% фетальною бичачою сироваткою (FBS) та 1% пеніциліном/стрептоміцином (Gibco, Карлсбад, Каліфорнія, США). Всі клітини витримували при 37 ° С у зволоженій атмосфері 5% -ного інкубатора СО2.

МТТ аналіз

Вплив смири на життєздатність клітин ГХ визначали за допомогою аналізу 3– (4,5 – диметилтіазол – 2 – іл) -2,5 – дифенілтетразолію броміду (МТТ, Sigma). Клітини BGC-823 та SGC-7901 висівали на 96-лункову мікропланшет (4 × 10 3 клітини на лунку) та інкубували протягом ночі у 10% середовищі FBS. Через 24 год клітини інкубували з різними концентраціями мирри (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 та 3 мг/мл) протягом 12, 24 або 48 год при 37 ° С. Безклітинне середовище використовували як пустий контроль. Згодом у кожну лунку додавали 200 мкл розчину МТТ (0,5 мг/мл) та інкубували протягом 4 год при 37 ° С. Потім у кожну лунку додавали 200 мкл диметилсульфоксиду (DMSO, Sigma). Ефекти інгібування проліферації кожної комбінації оцінювали за допомогою зчитувача мікропланшетів (MJ Research Inc.) при 570 нм [18].

Аналіз проточної цитометрії

Апоптоз клітин GC вимірювали за допомогою проточної цитометрії, використовуючи Додаток V, FITC Kit для виявлення апоптозу (Dojindo, Японія). Для кожної обробки збирали 2 × 105 клітин (0, 1, 1,5 та 2 мг/мл смири протягом 24 год) і двічі промивали, використовуючи холодний сольовий соль, забуференний фосфатом (PBS). Потім клітини ресуспендували в 0,6 мл зв’язуючого буфера і давали реагувати з 10 мкл міченого FITC анексину V і 10 мкл йодиду пропідію (PI) протягом 15 хв при кімнатній температурі в темряві. Потім клітини аналізували на проточному цитометрі (Бектон Дікінсон, Каліфорнія, США). Апоптоз оцінювали за допомогою анексину V-FITC та фарбування йодидом пропідію.

Фарбування Hoechst 33342

Морфологічні зміни були продемонстровані флуоресцентною мікроскопією з використанням фарбування Хохста. Клітини BGC823 та SGC7901 обробляли різними концентраціями мірри (0, 1, 1,5 та 2 мг/мл протягом 24 год), двічі промивали PBS та фіксували. Після двічі промивання PBS протягом 3 хв клітини фарбували 10 мкг/мл Hoechst 33342 (Beyotime, Китай) протягом 5 хв при кімнатній температурі та досліджували за допомогою флуоресцентної мікроскопії (Eclipse E-800; Nikon, Токіо, Японія). Апоптотичні клітини ідентифікували за допомогою ядерної фрагментації та конденсації хроматину.