Порівняльний вплив харчових консервантів на вироблення стафілококового ентеротоксину I з

1 Коледж життєвих наук і технологій, Південно-західний університет національностей, Ченду 610041, Китай

порівняльний

Анотація

1. Вступ

Золотистий стафілокок (S. aureus) є основним бактеріальним збудником, який викликає клінічну інфекцію та харчові хвороби [1]. Організм міцний, що дозволяє йому вирощувати багато харчових продуктів, які неправильно готуються чи зберігаються, і виробляє стафілококові ентеротоксини (СЕ). СЕ є збудниками харчових отруєнь стафілококовим шляхом (SFP) [2]. Незважаючи на те, що бактерії можуть бути знищені за допомогою термічної обробки їжі, СЕ є термостійкими. Таким чином, хоча бактерії еліміновані, токсини залишаться в їжі і згодом спричиняють SFP [3].

На сьогоднішній день виявлено більше двадцяти чотирьох SE та стафілококових ентеротоксиноподібних білків (SEls) та позначено як SEA SELY [4–6]. Ці SE/SEls традиційно поділяються на класичний (SEA на SEE) та новий тип (SEG на SElY). Передбачається, що СЕ - це токсини, що викликають блювоту; відповідні СЕЗ або не мають блювотної активності, або ще не досліджені [4]. За останні роки кілька досліджень вказують на те, що SEG та SEI можуть бути відповідальними за випадки SFP у людей [7–9]. Однак комерційні набори для імунологічного виявлення білка SEI наразі не доступні [10, 11]. Таким чином, є дуже обмежені дані про виробництво СЕІ.

Харчові консерванти широко застосовуються для зниження ризику харчових отруєнь. Звичайні консерванти - це синтетичні хімічні речовини, такі як нітрит натрію, бензоат натрію та сорбат калію. Через побічні ефекти використання штучних консервантів переглядається [12]. Зі зростанням попиту споживачів на природні консерванти для заміщення хімічних сполук розробляються нові протимікробні засоби різного походження, включаючи продукти тваринного походження (лізоцими, лактопероксидазу, хітозан, антимікробний пептид та інші), рослинні продукти (поліфеноли, ефірні олії), рослинні антимікробні пептиди та інші) та мікробні метаболіти (нізин, натаміцин, ε-полілізин, органічна кислота та інші). Ці продукти повинні бути досліджені на предмет можливості контролю харчових патогенів у продуктах харчування.

У цьому дослідженні проведено порівняльний вплив кількох харчових консервантів: нітриту натрію, полілізину, хітозану та катехіну чаю на ріст бактерій, сей експресія генів та позаклітинна секреція SEI із стійкого до пеніциліну S. aureus виявлено ізолят Н4, пов’язаний з харчовим отруєнням, для оцінки цих продуктів для використання в якості антимікробних засобів для консервування харчових продуктів.

2. Матеріали та методи

2.1. Підрахунок бактеріальних пластин
2.2. Кількісна ПЛР у реальному часі

Кількісна ПЛР у реальному часі була використана для виявлення відносного рівня мРНК сей в S. aureus Н4, оброблений харчовими консервантами. Після інкубації протягом 24 годин збирали 200 мл суспензії клітин і центрифугували при 10000

протягом 15 хв. Супернатант збирали для наступної кількісної оцінки білка SEI і клітини лізували за допомогою буфера ТЕ (10 ммоль/л Трис-HCl, 1 ммоль/л ЕДТА, рН = 8,0) з додаванням 3 мг/мл лізоциму. Загальну РНК екстрагували реагентом TRIzol® (Tiangen, Пекін, Китай) відповідно до протоколу продукту. Концентрацію РНК виявляли на спектрофотометрі (Biowave II, Biochrom, Великобританія) та 2 μg РНК використовували для синтезу кДНК шляхом зворотної транскрипції за допомогою реактивного набору PrimeScript® RT (Fermentas Life Science, Ганновер, Меріленд, США), як описано в інструкціях виробника.

Кількісну ПЛР на основі флуоресценції в реальному часі проводили за температури флуоресценції iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Конкретні праймери для сей геном, який ми раніше клонували (номер приєднання GenBank: KT853046.1), були sei-qF: 5′-TGCCTTTACCAGTGTTATT-3 ′ та sei-qR: 5′-AGGACAATACTTAAATTCTGCT-3 ′. Ці праймери були розроблені з програмним забезпеченням Primer Premier 5.0, а специфічність праймерів була оцінена за допомогою ПЛР. Умови для ампліфікації ПЛР становили 120 с при 95 ° С, після чого 39 циклів по 10 с при 95 ° С, 30 с при 55 ° С і 30 с при 72 ° С. Пороговий цикл (КТ) аналізували за допомогою a

метод [14]. FtsZ (праймери: FtsZ-F 5′-TGAAGATGCAATCCAAGGTG-3 ′ і FtsZ-R 5′-GTTAATGCGCCCATTTCTTT-3 ′) використовували як регулятор навантаження для нормалізації.

2.3. Сендвіч з подвійним антитілом ELISA

Сендвіч ELISA з подвійними антитілами був розроблений для виявлення секреції SEI від S. aureus H4 із введенням харчових консервантів, як описано раніше [13]. Коротко, 2.89 μг/мл моноклонального антитіла проти SEI у PBS наносили на мікротитрувальний планшет протягом ночі при 4 ° С; планшет блокували 5% знежиреним молоком у PBS при 37 ° С протягом 60 хв. 0,1 мл супернатанту S. aureus H4, зібраний на 24-й годині, додавали в кожну лунку при 37 ° С протягом 60 хв, інтенсивно промивали PBS, що містить 0,05% Твін-20, з подальшою інкубацією 0,1 мл поліклонального антитіла проти SEI (розведення 1: 1000) при 37 ° С протягом 60 хв і знову промивають. Потім до кожної лунки при 37 ° С протягом 60 хв додавали 0,1 мл козячої анти-кролячої IgG-пероксидази хрону (розведення 1: 6000, Санта-Крус, США) і знову промивали. Після цього використовували 0,1 мл розчину субстрату тетраметилбензидину (ТМВ) і, нарешті, H2SO4 використовували для припинення реакції. Вимірювання проводили при 450 нм фотометрично.