Повторний аналіз протеома матриці оболонки Lottia gigantea, включаючи кількісне визначення MaxQuant iBAQ та
Анотація
Передумови
Хоча значення білків біомінеральної органічної матриці та їх посттрансляційних модифікацій для біомінералізації загальновизнане, кількість опублікованих матричних протеомів все ще невелика. Це пов’язано здебільшого з відсутністю вичерпних баз даних про послідовності, які зазвичай походять від проектів геномного секвенування. Однак поглиблений протеомічний аналіз на основі мас-спектрометрії, який критично залежить від високоякісних баз даних послідовностей, є дуже швидким інструментом для виявлення кандидатів на функціональні білки біомінеральної матриці та їх посттрансляційні модифікації. Ідентифікація таких білків-кандидатів полегшується принаймні приблизним кількісним визначенням ідентифікованих білків, оскільки найбільш поширені з них також можуть бути найцікавішими кандидатами для подальшого функціонального аналізу.
Результати
Повторна кількісна оцінка раніше виявлених Лоттія білки матриці оболонки за допомогою методу абсолютного кількісного визначення на основі інтенсивності (iBAQ), реалізованого в програмі ідентифікації та кількісного визначення MaxQuant, показали, що лише 57 із 382 прийнятих ідентифікацій становили 98% від загальної кількості виявлених протеомів матриці. Ця група білків не містила очевидних внутрішньоклітинних білків, таких як цитоскелетні компоненти або рибосомні білки, незмінно ідентифіковані як другорядні компоненти високопродуктивних протеом біомінерального матриксу. Чотирнадцять з цих основних білків були фосфорильовані у різній мірі. Разом ми виявили 52 ділянки фосфо у 20 із 382 прийнятих білків з високою довірою.
Висновки
Ми показуємо, що кількісне визначення iBAQ може бути корисним інструментом для звуження групи кандидатів на функціональний білок біомінеральної матриці для подальших досліджень у клітинній біології, генетиці або дослідженнях матеріалів. Знання посттрансляційних модифікацій цих основних білків може бути цінним доповненням до раніше опублікованих протеомів. Особливо це стосується фосфорилювання, оскільки ця модифікація вже була показана для модифікації процесів мінералізації в деяких випадках.
Вступ
Нещодавно опубліковані геноми біомінералізуючих організмів дозволяють проводити аналіз біомінеральних протеом та фосфопротеомів на основі масової спектрометрії, що сприяє швидкій ідентифікації фосфопротеїнів та місць фосфорилювання [15, 16]. У цьому дослідженні ми додаємо фосфопротеом Lottia gigantea матриця оболонки до нещодавно опублікованої Лоттія протеоми оболонки [17, 18]. Крім того, ми повторно визначили Лоттія протеом оболонки за допомогою методу iBAQ (абсолютна кількісна оцінка на основі інтенсивності) [19], реалізованого в MaxQuant. Це показало, що 57 білків становлять 98% від загальної кількості виявлених протеомів. Ми припускаємо, що кількісне визначення дозволяє ідентифікувати основні білки, які є найбільш вірогідними кандидатами для функціональних білків оболонки, зберігаючи інформацію про другорядні білки, незалежно від того, відіграють ці другорядні білки роль у мінералізації чи ні, і незалежно від того, відбуваються вони внутрішньо - або екстракристалічні.
Матеріали і методи
Препарат матриці та фосфопептиду
Фосфопептиди збагачувались оборотним зв'язуванням з гранулами TiO2 (Titansphere 10 мкм, GL Sciences, Японія), дотримуючись встановлених протоколів [21], але замінюючи 2,5-дигідроксибензойну кислоту в завантажувальному буфері 6% трифтороцтовою кислотою (TFA) [22]. Коротко кажучи, намистини промивали спочатку 80% ацетонітрилом, що містить 0,1% TFA (промивний буфер), потім 80% ацетонітрилом, що містить 6% TFA (зв'язуючий буфер). Пептиди розчиняли в зв'язуючому буфері (200 мкл/пептиди з матрицею 2 мг) і додавали приблизно до 5 мг негранульованих гранул TiO2. Суміш інкубували на обертовому колесі протягом 45 хв. Після центрифугування супернатант знову інкубували зі свіжими гранулами TiO2, як і раніше. Потім намистини двічі промивали 200 мкл зв’язуючого буфера, а потім 2 × 200 мкл промивного буфера. Нарешті завантажені кульки заповнювали в підказки стадії C8, а фосфопептиди елюювали 2 × 100 мкл розчину, що містить 40% ацетонітрилу та 15% аміаку. Елюат сушили у вакуумі в концентраторі Еппендорфа до
20 мкл і підкислюють TFA. Пептиди очищали на стадіях С18 [23] після розведення до 200 мкл 0,5% оцтової кислоти.
LC-MS аналіз
Збагачені фосфопептидом зразки аналізували на високоефективному спектрометрі Quadrupole Orbitrap Q Exactive (Thermo Fisher Scientific, Бремен, Німеччина) [24], підключеному до нанопотокової системи HPLC Easy-nLC 1000 (Thermo Fisher Scientific). Пептиди розділяли на 50-сантиметровій колонці з внутрішнім діаметром 75 мкм, заповненій 1,8 мкм кульками C18 (Reprosil-AQ Pur, Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, Німеччина), підготовлених, як описано [25]. Пептиди елюювали ацетонітрилом в 0,1% мурашиної кислоти, використовуючи градієнт 5-30% ацетонітрилу через 95 хв, 30-60% через 30 хв і 60-95% через 8 хв при потоці 250 нл/хв і температурі колонки 50 ° C [25]. Мас-спектри отримували залежно від даних шляхом автоматичного перемикання між MS та MS/MS у підході до топ-10. Роздільна здатність становила 70000 для повних спектрів та 17500 (обидва при m/z 200) для фрагментів, отриманих HCD. Час динамічного виключення становив 30 сек.