Протигерпетичні ефекти Gynura procumbens
1 кафедра фармакогнозії, фармацевтичний факультет, університет Махідол, 447 Шрі Аюдхья Роуд, район Раджатеві, Бангкок 10400, Таїланд
2 Відділ фармацевтичних та натуральних продуктів, Таїландський інститут наукових і технологічних досліджень, Патхум Тані 12120, Таїланд
3 Відділ дерматології, Медичний факультет, Медичний факультет, лікарня Раматхібоді, Університет Махідол, Rama VI Road, Бангкок 10400, Таїланд
4 кафедра мікробіології, лікарня, лікарня Сірірадж, дорога Праннок, район Бангкок-Ной, Бангкок, 10700, Таїланд
5 Кафедра патології медичного факультету лікарні Раматхібоді, Університет Махідол, Rama VI Road, Бангкок 10400, Таїланд
6 Кафедра медичної хімії, Вікторіанський фармацевтичний коледж, Університет Монаш, Мельбурн, VIC 3052, Австралія
7 Кафедра фармацевтичної та лікарської хімії, Інститут фармацевтичних наук, Фрайбурзький університет, 79104 Фрайбург, Німеччина
Анотація
1. Вступ
Gynura procumbens (Lour.) Merr. згадується в традиційній китайській медицині як місцевий протизапальний засіб [1]. У Південно-Східній Азії, Гінура рослини широко поширені. У Таїланді, G. pseudochina змінний. гіспіда (Тайська назва: Wan Mahakaan) зовнішньо використовується як протисвербіжний, протизапальний та протигерпетичний вірус [2]. У Сінгапурі, Малайзії та Індонезії рослина традиційно використовується як ліки від висипної лихоманки, висипу, хвороб нирок, мігрені, запорів, гіпертонії, цукрового діабету та раку [3]. Екстракт етанолу з листа зменшував набряк вух миші, викликаний олією кротону [4]. Фітохімічні дослідження Росії Гінура рослини виявили відкриття алкалоїдів піролізидину [5–7], спіростанолу [8], кумаринів [7–9] та антоціанів [10]. Оскільки G. procumbens до цих пір не досліджували вірусної активності проти герпесу, з іншого боку, згідно з традиційною тайською медициною, використання рослини може бути пов'язане з вірусною герпетичною інфекцією; проводиться дослідження рослинних компонентів на антигерпетичну активність.
2. Матеріали та методи
Рослинний матеріал. Gynura procumbens було зібрано з провінції Чантабурі, Таїланд, у жовтні 1994 року. Рослина була ідентифікована пані Ліною Фупатпонг, експертом-ботаніком Лісового гербарію (BKF), Королівського лісового департаменту, Міністерство сільського господарства та кооперативів, Бангкок, Таїланд. Зразок ваучера (BKF № 127362) був депонований там же.
Видобування та ізоляція. Надземні частини рослини (25 кг, свіжі) промивали, розрізали на шматки, сушили у пічі на повітрі (60 ° C) і подрібнювали, отримуючи 1,7 кг порошку грубого порошку. Його послідовно екстрагували в апараті Сокслета з використанням петролейного ефіру (40–60 ° C), дихлорметану та етанолу. Розчинники видаляли при зниженому тиску. Сухий етаноловий екстракт (114 г) додатково відокремлювали за допомогою хроматографічних колон з різними пакувальними матеріалами. Колонка гелю MCI CHP20P фракціонувала екстракт на фракції F1 (вода), F2 (вода-метанол 1: 1), F3 (метанол) та F4 (етилацетат). F2, F3 та F4 були активними щодо вірусу герпесу.
F2 (12,3 г) і F3 (6,4 г) поступово хроматографували на гелі MCI CHP20P, використовуючи водний метанол (1: 1) для F2 і метанол для F3 як системи розчинників, в результаті чого отримували F2,1 (8,7 г), F2,2 ( 0,75 г) та F2,3 (0,8 г) та F3,1 (2,0 г), F3,2 (3,0 г) та F3,3 (0,8 г) відповідно. Сполуки 1, 2, 3, 4, і 5 були виділені з F2 (рис. 1), тоді як сполуки 6, 7, 8, і 9 були виділені з F3 (рис. 2). F4 додатково не вивчався.
Клітинна лінія. Клітинна лінія Vero (клітини нирок африканської зеленої мавпи) вирощувалась і підтримувалась у мінімальному незамінному середовищі Ігл (MEM), доповненому 10% фетальної телячої сироватки та антибіотиків (
Вірус. HSV-1, штам KOS та HSV-2, штам Baylor 186, були отримані з кафедри мікробіології лікарні Siriraj Hospital лікарні Mahidol University, Бангкок, Таїланд. Для експериментів використовували кількість 100 одиниць, що утворюють наліт (PFU) на мл.
Оцінка цитотоксичності. Послідовні 2-кратні розведення досліджуваного зразка в середовищі, що підтримує, додавали до моношару Vero. Після інкубації при температурі 37 ° C протягом 5 днів цитотоксичність визначали шляхом життєво важливого фарбування 1% кристалічно-фіолетовим у 10% формаліні протягом 30 хв. Найвища концентрація досліджуваного зразка, яка не виявляла цитотоксичності, представляла максимальну нетоксичну дозу (MNTD). Для проведення антивірусного аналізу використовували серійні 2-кратні розведення MNTD.
Противірусний аналіз. Противірусну активність визначали за допомогою аналізу зменшення нальоту на злитті клітинах Vero, що ростуть на 96-лункових планшетах для культури тканин. Тест включав три методи лікування, тобто інактивацію та попередню та подальшу обробку.
Інактивація (Для визначення нейтралізуючої активності досліджуваного зразка проти зараженості вірусом (віруліцидна дія)): вірус (100 μL) інкубували з досліджуваним зразком (100 μL) при 37 ° C протягом 1 год. Суміш додавали в продубльовані лунки одношарових клітин і інкубували при 37 ° С протягом 1 години. Після промивання клітин до культур додавали MEM та напівтверде середовище (0,4% трагаканта камеді), які потім інкубували при 37 ° С протягом 3 днів і фарбували кристалічно-фіолетовим.
Попередня обробка (для визначення інгібуючої активності вірусної адсорбції або проникнення): тест-зразок (100 μL) додавали до продубльованих лунок одношарових клітин та інкубували при 37 ° C протягом 24 годин. Після промивання культури клітини заражали вірусом (100 μL) та інкубували при 37 ° C протягом 1 години. Напівтверді середовища додавали до продубльованих лунок одношарових клітин після вимивання неадсорбованого вірусу. Культури інкубували при 37 ° С протягом 3 днів, а потім фарбували кришталево-фіолетовим кольором.
Післялікування (для визначення інгібуючої активності внутрішньоклітинної реплікації вірусу): одношарові клітини інфікували вірусом та інкубували при 37 ° С протягом 1 години. Після промивання клітин досліджуваний зразок (100 μL) і напівтверді середовища додавали в продубльовані лунки, інкубували при 37 ° С протягом 3 днів, а потім фарбували кришталево-фіолетовим.