Різниця у вираженні, змісті та активності 11β-HSD1 в жировій тканині між ожирілими чоловіками

А. Торрес

1 Інститут досліджень матері та дитини, Медичний факультет, Чилійський університет, Касілла 226-3, 8360160 Сантьяго, Чилі

Г. Інігес

М. Ферраріо

2 Хірургічне відділення, Клініка Лас Кондес, Сантьяго, Чилі

В. Мерік

Анотація

У всіх суб'єктів, що передували операції, брали зразок крові натще. Антропометричну інформацію (вік, вагу та зріст) отримували з клінічних даних кожного суб’єкта.

Під час процедури було отримано 5 г вісцеральної жирової тканини (VAT) та 5 г підшкірної жирової тканини (SAT). Зразки були отримані з Центру хірургії ожиріння в м. Клініка Лас Кондес та клінічної лікарні Сан-Борха-Арріаран у Сантьяго, Чилі. Протокол дослідження був схвалений Інституційною комісією з огляду Клініка Лас Кондес, і всі пацієнти давали письмову інформовану згоду при прийомі на роботу.

2.1. Обробка жирових тканин

Під час операції був отриманий зразок жирової тканини з підшкірного та вісцерального відділів. Обидва зразки очистили, негайно розділили і заморозили в рідкому азоті і витримали при –80 ° C для загальної екстракції РНК та аналізу білка.

2.2. Біохімічні аналізи сироватки крові

Інсулін у сироватці крові визначали за допомогою IRMA (DIAsource, Бельгія), з коефіцієнтами варіації (CV) у межах та між аналізами 2,1 та 4,5% відповідно. Глюкозу вимірювали методом глюкозооксидази від фірми Roche Diagnostics (Мангейм, Німеччина), з інтра-аналізом та коефіцієнтом взаємодії 2,5%. Загальний холестерин, тригліцериди та холестерин ЛПВЩ та ЛПНЩ у сироватці крові визначали кількісно за допомогою системи діагностики Рефлотрон (Діагностика Roche). Тригліцериди вимірювали ферментативно за допомогою спектрофотометричного методу. Внутрішньо- та міжвипробувальне значення CV становило 1,9 та 3,7% відповідно. Чутливість до інсуліну (ІС) оцінювали на основі інсуліну натще (I0) та рівня глюкози за допомогою моделі гомеостазу (HOMA-IR) [13].

2.3. Експресійні аналізи

2.3.1. Повне виділення та кількісне визначення РНК

Загальну РНК екстрагували із приблизно 100 мг ПДВ та SAT, використовуючи реагент TRIzol (Invitrogen Corp., CA, USA) відповідно до інструкцій виробника. Шматочки жирової тканини гомогенізували в 1 мл TRIzol, доповненого глікогеном (0,25 мг/мл, Amersham Life Sciences), використовуючи механічний гомогенізатор (Kontes Glass Company, Vineland, NJ, США), фази розділяли центрифугуванням (12000 об/хв протягом 20 хв при 4 ° C) після додавання хлороформу. Для осадження РНК до супернатанту додавали ізопропанол і центрифугували при 12000 об/хв протягом 15 хв при 4 ° С. Гранулу промивали в 500 мкл 75% етанолу. РНК ресуспендували у воді, обробленій діетилпірокарбонатом. Цілісність РНК оцінювали електрофорезом на 2% (мас./Об.) Агарозних гелях, і кількість визначали спектрофотометрично в NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA). Комплементарну ДНК синтезували з 2 мкг загальної РНК, перевареної раніше ДНКазою I (Fermentas, США), використовуючи випадкові праймери (Invitrogen) та 200 U зворотної транскриптази RevertAid H Minus M-MuLV (Fermentas), дотримуючись інструкцій виробника.

2 мкл кДНК використовували для ампліфікації 11β-HSD1, відрегульованого до загального об’єму 25 мкл, додаючи ПЛР-буфер, що містить 3 ммоль/LMgCl2, 0,63 U Taq ДНК-полімерази (Invitrogen), суміш нуклеотидів та 0,4 мкмоль/л кожного з двох конкретні праймери (вище за течією: 5 ′ ′ - AGGAAAGCTCATGGGAGGACTAG-3 ′ ′ і нижче за течією: 5 ′ ′ - ATGGTGAATATCATCATGAAAAAGATTC-3 ′ ′). Реакцію проводили в Thermocycler PT-100 (MJ Research Inc., Watertown, MA, USA), використовуючи умови, які були раніше стандартизовані: денатурація при 94 ° C протягом 1 хв; відпал при 55 ° С протягом 1 хв; продовження при 72 ° С протягом 1 хв 30 сек і повторювати їх протягом 31 циклу.

Як внутрішній контроль, кДНК 18S рРНК ампліфікували в кожному зразку при тих же умовах, описаних вище, за винятком 1,5 ммоль/л MgCl2 і повторювали протягом 18 циклів. Щоб визначити, що ампліфікація всіх генів була в лінійному діапазоні, ми оцінили лінійність ампліфікації відповідних транскриптів в жировій тканині і згодом вибрали кількість циклів. Амплікони (139 п.о., для 11β-HSD1 та 191 п.н. для 18S рРНК) візуалізували на 2% агарозному гелі, використовуючи GelRed Nucleic Acid Stain (Biotium). Напівкількість продуктів ПЛР проводили за допомогою аналізу зображень (система документації та аналізу електрофорезу KODAK EDAS 290, програмне забезпечення для аналізу зображень Kodak 1D). Результати виражаються як співвідношення між дослідженим мРНК геном/18S рРНК (AU = довільні одиниці).

2.4. Ферментативні аналізи

Екстракція білка -

Тканини VAT та SAT гомогенізували в крижаному 0,1 М PBS pH 7,5, доповненому антипротеазами (Complete, Mini, коктейльні таблетки, що не містять ЕДТА, інгібітори протеази, Roche Applied Science). Потім гомогенат тканини центрифугували при 12000 об/хв протягом 30 хв при 4 ° C, і отриманий супернатант збирали та аналізували на концентрацію білка, використовуючи набір для аналізу білка BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) із BSA як стандарт.

2.4.1. Ферментативна активність 11β-HSD1

Ферментативний аналіз був раніше описаний Mericq та співавт. [14], модифікований відповідно до типу досліджуваної тканини. Умови реакції встановлювали з використанням різних концентрацій кофактора, неміченого кортизону та часу інкубації. Також оцінювали лінійність ферментативної реакції.

Коротко кажучи, 200 мкг білкового екстракту інкубували в 0,5 мл фосфатного буфера (0,1 моль/л рН 7,6) у присутності 25000 ц.м. [3] -кортизону (Amersham, Великобританія), 0,05 мкМ кортизону та 400 мкМ NADPH (Sigma Chemicals). Реакцію ініціювали додаванням кофактора протягом 24 год при 37 ° С на струшуючій водяній бані. Аліквоти екстрагували в 7 обсягів дихлорметану, а стероїди відокремлювали за допомогою високоефективної тонкошарової хроматографії (HPTLC, Merck), використовуючи метанол-хлороформ (8: 92) як рухому фазу. Смуги, що містять мічений кортизон і кортизол, ідентифікували за допомогою УФ-світла холодних носіїв, розрізали та підраховували в сцинтиляційному лічильнику (Tracor Analytic Delta 300). Норми кортизону до кортизолу розраховували на основі питомої активності міченого кортизолу та радіоактивності кортизолу (пікограми), що утворюється на мг білка на годину.

2.4.2. Вестерн-блот-аналіз

Рівні кількості (12,5 мкг) жирових білків розчиняли електрофорезом із застосуванням 14% гелів SDS-поліакриламіду, а потім переносили в нітроцелюлозні мембрани (Bio Rad Laboratories, Геркулес, Каліфорнія, США). Мембрани блокували 5% BSA в TBS-T (20 ммоль/л трис рН 7,2, 137 ммоль/л NaCl, 0,1% (об/об) Твін-20) протягом 1 год при кімнатній температурі. Пляки досліджували антитілами проти 11β-HSD1 (Санта Круз Біотехнологія, Санта Круз, Каліфорнія, США) та β-актином (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США). Після тривалого промивання смуги виявляли з відповідними кон’югованими з пероксидазою хрону вторинними антитілами (Rockland Immunochemical Research, Gilbertsville, PA, USA) з подальшим посиленням хемілюмінесценції (ECL плюс система Western Blotting Detection System; Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK). Зображення отримували та оцінювали за допомогою програмного забезпечення для збору та аналізу зображень UltraQuant (Ultralum Inc., Клермонт, Каліфорнія, США), нормалізованого щодо β-актину та вираженого як довільні одиниці (AU).