Стимуляція норадренергічної передачі ребоксетином корисна для мишачої моделі
Предмети
Анотація
Вступ
Хвороба Паркінсона (БП) - друге за поширеністю нейродегенеративне розлад, що вражає до 3% людей похилого віку (> 65 років). PD характеризується руховим дефіцитом, таким як тремор, ригідність та брадикінезія 1. Ці симптоми в основному спричинені втратою дофамінергічних нейронів, розташованих у чорній речовині (SN) та вентральній тегментальній ділянці (VTA). Оскільки понад 90% випадків ПД мають спорадичне походження, у лікуванні захворювань досягнуто незначних успіхів. Протягом останніх 40 років дослідники зосереджувались на фармакологічному посиленні передачі дофамінергічного препарату, яке зазвичай здійснюється, коли більшість нейронів вже немає.
Це дослідження мало на меті зрозуміти, чи може фармакологічне посилення норадренергічної передачі, досягнуте або хронічним застосуванням селективного інгібітора зворотного захоплення NA (ребоксетин, REB), або антагоністом альфа2-AR (атипамезол, APM) може полегшити рухові ефекти прогресуючої втрати дофамінергічних нейронів та чи може ця норадренергічна стимуляція мати якийсь сприятливий вплив на виживання дофамінергічних нейронів та вміст дофаміну в смугастих тканинах у мишачої моделі прогресуючого паркінсонізму.
Для перевірки цієї гіпотези ми використали умовну нокаутовану модель миші, у якій відсутній фактор ініціації транскрипції-IA (TIF-IA), що характеризується індуцируемим пригніченням основної клітинної функції, такої як синтез рРНК у дофамінергічних нейронах, щоб викликати їх прогресивну нейродегенерацію 11 . Ці миші-мутанти імітують багато ознак PD, включаючи прогресивну та селективну вразливість нейронів SN, дефіцит рухової координації, а також посилення дисфункції мітохондрій та збільшення пошкодження окисного стресу 11. Важливо, як було показано раніше, деякі ефекти цієї мутації можуть бути частково врятовані введенням L-DOPA 11, а також інгібуванням проапоптотичних сигнальних шляхів, таких як p53, та посиленням головного регулятора синтезу білка, механістичної мішені. рапаміцину (mTOR) 11,12, що підтверджує їх потенційне використання як моделі для модифікуючої хвороби терапії проти дофамінергічної нейродегенерації.
Матеріали і методи
Тварини
Селективна абляція TIF-IA у дофамінергічних нейронах (миші TIF-IA DATCreERT2) була досягнута за допомогою Cre/loxP підхід. Проведення трансгенних мишей Cre рекомбіназу під промотором допамінового транспортера (DAT) (миші DAT CreERT2) схрещували з тваринами, що містять флоксированний ген TIF-IA, як описано раніше 11. Самців-самців-мутантів мишей утримували з контрольними (Cre-негативними) одноплідниками тієї самої статі в самовентильованих клітинах у стандартних лабораторних умовах (12 год цикл світло/темно, їжа та вода ad libitum). Дослідження проводилось у суворій відповідності з рекомендаціями Керівництва з догляду та використання лабораторних тварин Національних інститутів охорони здоров’я. Протокол усіх поведінкових досліджень був затверджений Комітетом з етичного контролю тварин при Інституті фармакології Польської академії наук (Номер дозволу: 951/2012, виданий: 28.06.2012).
Наркотики та графік експериментів
Щоб активувати залежну від тамоксифену рекомбіназу CreERT2 у дорослих мишей (віком 12 тижнів) та викликати мутацію, ми застосували тамоксифен (TAM) (Sigma-Aldrich, США), розчинений у олії в дозі 1 мг/миша, 2 × на день протягом 5 днів поспіль, за 4 тижні до введення досліджуваних препаратів. Контрольні (з масою) тварини отримували лише олію. Ребоксетин (REB) (Tocris Bioscience, США) та атіпамезол (APM) (Antisedan, Orion Pharma, Польща) вводили один раз на день протягом 21 дня поспіль у дозах 20 мг/кг та 3 мг/кг відповідно. Контрольні групи отримували 0,9% NaCl. Всі поведінкові та біохімічні аналізи проводили через 7, 10 та 13 тижнів після ін'єкцій ТАМ (ТАМ + 7, ТАМ + 10, ТАМ + 13), як показано на рис. 1.
Блок-схема, що узагальнює експериментальний дизайн. ТАМ - тамоксифен, РЕБ - ребоксетин, АРМ - атіпамезол; ТАМ + 7, ТАМ + 10, ТАМ + 13: 7, 10, 13 тижнів після індукції мутації (застосування тамоксифену).
Тест Ротарода
Для оцінки координації рухів проводили тест на ротарод. Тест проводили на прискореному ротароді (Уго Базиле, Італія). Оцінюванню передувало тренувальне заняття за день до першого експерименту (5 хв на обертовій штоці з постійною швидкістю). Під час експериментальних сеансів, проведених на 7, 10 і 13 тижнях після ін'єкції тамоксифену, вимірювали час, проведений на прискорювальному стрижні (4 до 40 об/хв протягом 5 хв).
ВЕРХ-аналіз
Імуногістохімія
Процедуру проводили, як описано раніше 14, з деякими змінами. Коротко кажучи, мозок видалили, зафіксували на 48 год у 4% параформальдегіді (PFA), промили та перенесли на 0,4% PFA. Після фіксації мозок розрізали на вібратомі (Leica, Німеччина) на ділянки 30 мкм. Зрізи середнього мозку, включаючи SN/VTA, інкубували протягом ночі при 4 ° C з первинним антитірозингідроксилазою (TH) (1: 500, Millipore, США, кішка № AB1542) антитілом. Візуалізацію зв’язаного з антигеном первинного антитіла проводили з використанням відповідного біотинільованого вторинного антитіла з наступною інкубацією з комплексом Авідін/Біотин (ABC; Vector Laboratories, США) та фарбуванням діамінобензидину (DAB; Sigma, США). Забарвлені зрізи отримували та аналізували під світловим мікроскопом (Nikon Eclipse50i, Японія), оснащеному камерою та програмним забезпеченням NIS Elements. Кількісне визначення TH-позитивних клітин (TH +) проводили вручну, підраховуючи всі клітини TH + на сусідніх зрізах від 6 тварин кожного генотипу/лікування в односліпому експерименті.
Первинні ембріональні культури клітин середнього мозку та медикаментозне лікування
Статистичний аналіз
Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення Graph Pad Prism 7. Дані оцінювали за допомогою двостороннього дисперсійного аналізу (двосторонній ANOVA, генотип × лікування) з багаторазовим порівнянням біологічно релевантних груп (з урахуванням 3 різних часових точок аналізу) з подальшим тестом ЛСД Фішера після спеціального тесту. Значення Р нижче 0,05 вважали статистично значущими.
Результати
Лікування ребоксетином покращувало рухові порушення у мишей TIF-IA DATCreERT2
Як зазначено на рис. 1, ми викликали умовну абляцію TIF-IA шляхом ін'єкції TAM і розпочали 21-денну терапію REB або APM через 4 тижні після TAM, час, необхідний для ефективної TAM-індукованої рекомбінації. Щоб дослідити, чи може REB або APM мати якийсь позитивний вплив на рухові дефіцити, спричинені поступовою втратою дофамінергічних нейронів у мишей TIF-IA DATCreERT2, ми протестували контрольних та мутантних тварин у три різні часові моменти (7, 10 та 13 тижнів після TAM (TAM + 7, TAM + 10 і TAM + 13) Ротародом. На підставі попередніх експериментів, попередньо показано, що ці стадії призводять до прогресуючого паркінсонізму, починаючи з TAM + 7 (без будь-якої втрати клітин) і розвиваючись у важкому поведінковому фенотипі асоційоване з глибокою дофамінергічною дегенерацією при TAM + 13 11. Як і очікувалось, у мишей TIF-IA DATCreERT2, які отримували VEH, виявлено значне зниження витривалості (на 57,7% порівняно з контролем, тварини, оброблені VEH, двосторонній ANOVA: генотип F (2218 ) = 12,63; p Рисунок 2