Сульфід водню пом’якшує тривожні, рухові та когнітивні дисфункції у щурів з материнською
Ольга Яковлєва
Ксенія Богатова
Рената Мухтарова
Олексій Яковлєв
Вікторія Шахматова
Олена Герасимова
Гузель Зіятдінова
2 Кафедра аналітичної хімії Казанського федерального університету, вул. Кремлевська, 18, 420008 Казань, Росія; ur.liam@gavonidtayiz
Антон Герман
3 Департамент біологічних наук, Університет Зальцбурга, Зальцбург 5020, Австрія; [email protected]
Гузель Ситдікова
Пов’язані дані
Анотація
1. Вступ
Сірководень (H2S), створений як третій газотрансмітер разом з оксидом азоту та оксидом вуглецю, ендогенно продукується в різних тканинах і опосередковує численні фізіологічні та патофізіологічні процеси [1,2]. У центральній нервовій системі H2S сприяє індукції довготривалого потенціювання [3], покращує пам'ять про страх у літніх щурів [4], модулює збудливість нейронів [5,6], підвищує рівень внутрішньоклітинного Са 2+, генерує хвилі Са 2+ в астроцитів [7], і бере участь у генерації та проведенні соматичного та вісцерального болю [8,9]. Недавні дослідження вказують на нейропротекторну роль H2S у різних неврологічних патологіях [10,11], включаючи хворобу Альцгеймера та [12] хвороба Паркінсона [13], епілепсію [14] або мозкову травму після ішемічного інсульту [15] через антиоксидантні особливості H2S [2,16].
Кілька авторів повідомили, що у виробництві H2S задіяні чотири ферментативні шляхи: β-синтаза цистатіоніну (CBS), γ-ліаза цистатіоніну (CSE) та 3-меркаптопіруват сульфуртрансфераза (3MCT) у поєднанні з цистеїн амінотрансферазою (CAT) і 3MCT в поєднанні з D-амінокислотною оксидазою (DAO) [2,11,17,18,19]. CBS та CSE є ферментами, залежними від 5-фосфату (PLP), що знаходяться в цитозолі, тоді як незалежний від PLP 3-MST в основному генерує H2S в мітохондріях. Експресія ферментів, що продукують H2S, є специфічною для тканини. CBS та 3-MST знаходяться переважно в центральній нервовій системі, хоча ці ферменти також присутні в периферичних тканинах, тоді як CSE рясно зустрічається в печінці та судинних та несудинних гладких м'язах [2,11,17,18,19].
Підвищений рівень гомоцистеїну впливає на концентрацію H2S та експресію/активність ферментів, що генерують H2S, in vitro та in vivo [11,20]. Інтрацеребровентрикулярна ін’єкція гомоцистеїну знижувала експресію CBS та CSE у гіпокампі щурів та призводила до дисфункцій навчання та пам’яті [35,36]. У нашому попередньому дослідженні введення донора H2S самкам щурів з hHcy під час вагітності відновлювало порушення розвитку потомства протягом перших 3 тижнів після народження [28]. Метою цього дослідження є оцінка впливу донора H2S на тривожність, рухову та когнітивну поведінку, рівень окисного стресу в тканинах мозку, концентрацію H2S та активність/експресію CBS у дорослих щурів з материнською hHcy.
2. Матеріали та методи
2.1. Тварини
Експерименти проводились із використанням щурів Wistar відповідно до Директиви ЄС 2010/63/EU для експериментів на тваринах та Місцевого етичного комітету Казанського федерального університету (протокол № 8 від 5 травня 2015 р.). Тварин розміщували в клітинах з поліпропілену (32 × 40 × 18 см) при контрольованій температурі (22–24 ° C), із світловим графіком 12:12 L/D (світло вмикається о 6:00) та вільним доступом до їжі води.
Вагітних щурів розподілили на чотири групи наступним чином: одну групу годували ad libitum контрольною дієтою (n = 7), друга група (n = 11) отримувала щодня метіонін (7,7 г/кг маси тіла) з їжею, починаючи з 3 тижнів до і під час вагітності та годування груддю до відлучення від грудей P21 [29,37]. Третя група (n = 4) отримувала донора H2S, гідросульфід натрію (NaHS) за три тижні до і протягом вагітності за наступним протоколом: 7 днів ін’єкцій чергували з 7 днями адаптації [28]. Щури четвертої групи (n = 4) отримували щоденно метіонін та ін'єкції NaHS згідно з вищезазначеними протоколами (рис. 1а). NaHS розводили у стерилізованому фізіологічному розчині та вводили підшкірно (внутрішньовенно) в дозі 3 мг/кг.
Тестування поведінки, аналіз окисного стресу та рівня H2S, активності та експресії ЦБС у тканинах мозку проводили у віці P72–90, за винятком тесту на лабіринт Morris Water, який проводили при P21–22 (рис. 1, а). Оскільки не було зареєстровано суттєвих відмінностей між самцями та самками щурів, дані були об’єднані для подальшого аналізу
2.2. Тестування поведінки
2.2.1. Відкрите поле
Рухову активність та тривожність аналізували за допомогою тесту на відкритому грунті. Щурів окремо розміщували на квадратній арені розміром 100 × 100 см зі стіною висотою 36 см, розділеною на 25 квадратів 20 × 20 см (Open Science, Москва, Росія), обладнаній відеосистемою. Щура помістили в центр відкритого поля і дозволили досліджувати апарат протягом 3 хв з відстеженням квадратних схрещувань, вирощування, догляду, дефекації та активності зони центра [38]. Кожній тварині була надана оцінка загальної рухової активності, обчислена як сума квадратних схрещувань та кількості тилів. Після кожного випробування відкрите поле очищали 70% етиловим спиртом і давали йому висохнути між випробуваннями.
2.2.2. Витривалість м’язів
Витривалість м’язів оцінювали за допомогою тесту на витривалість лапи (PaGE) [39]. Щурів клали на дротяну сітку і обережно струшували, щоб спонукати щура схопити сітку. Сітку було перевернуто догори дном над кліткою корпусу та утримували на
0,45 м над відкритим дном клітки. Оцінювали час (-і), проведений (-і) у сітці до падіння. Для аналізу було використано найбільше значення з трьох окремих досліджень.
2.2.3. Тест Ротарода
Тест Ротарода був використаний для оцінки рухової координації передніх і задніх кінцівок та рівноваги (Neurobotix, Москва, Росія) [40]. Кожного щура поміщали на стержень із швидкістю обертання десять обертів на хвилину (об/хв) і вимірювали час падіння та дистанцію бігу. Тварин піддають трьом послідовним тестовим сесіям (випробуванням) з інтервалом 20–30 хв. Зафіксовано найкращу затримку падіння з обертового стрижня [41].
2.2.4. Завдання насіння соняшнику та тест на обробку вермішелі
Завдання насіння соняшнику та тест на обробку вермішелі використовували для оцінки тонкого моторного контролю. У завданні насіння соняшнику була оцінена здатність тварин використовувати кінцівки та пальці під час споживання насіння соняшнику [42]. Тварин тренували три дні поспіль, а на четвертий день поведінку реєстрували та знімали на відео. Під час випробування щура поміщали в прозорий оргскло (50 × 50 × 50 см) з п’ятьма насінням соняшнику в кутку ящика. Було зафіксовано загальну кількість часу, яке щур витрачав на маніпуляції, розкриття та споживання насіння, а також кількість залишків шкаралупи. Експериментатор починав вимірювати час, коли тварина торкнулася першого насіння, і зупиняв таймер кожного разу, коли тварина відволікалася.
Під час випробування вермішелі щурам давали сирі вермішелі (довжиною 7 см і діаметром 1,5 мм) і спостерігали узгоджені асиметричні схеми руху лап і рота. Найчастіше щури тримають довгий шматок в обох лапах і рухають його в рот, використовуючи узгоджений асиметричний малюнок тримання, коли однією лапою утримують шматок цілим захопленням лапи, а іншою - для введення шматка в рот, часто підказки щодо цифр [43]. Атипові моделі поведінки оцінювали згідно з попередніми дослідженнями [43,44] і включали такі закономірності: (1) Лапи симетричні (без чіткого розділення функцій) при вживанні довгих макаронних виробів; (2) перемикання функцій лап з провідного на захоплення під час їжі; (3) одна з лап не контактує з макаронами під час їжі, лише для регулювання шматка макаронних виробів; (4) шматок макаронних виробів опускається під час їжі; (5) рот використовується для протягування шматка макарони через лапи; (6) згорблена поза, коли щур нахиляється над шматочком макаронних виробів і рухає ротом вниз, поки шматок стає менше. Тест складався з трьох випробувань із шматочками макаронних виробів, що давались по одному за кожне випробування. Щура поміщали в прозору оргскло і випробування знімали на відео для аналізу.