Тонкі плівки ДНК-платина для використання в дослідженнях хіміопроменевої терапії

Мохаммад Резі

Групи наук про радіацію, Департамент медицини та радіобіології, Факультет медицини та науки Санта, Університет Шербрук, Шербрук, КК, Канада J1H5N4

Елахе Алізаде

Дарель Полювання

Леон Санче

Анотація

1. Вступ

10 нм) LEE у біологічних речовинах, такі дослідження необхідно проводити на дуже тонких плівках ДНК подібної товщини. Тонкі плівки Pt-ДНК можуть надати експериментальний підхід для дослідження безпосереднього впливу вторинних електронів та інших частинок короткого діапазону (або вторинних видів) на ДНК в присутності сполук Pt. Такі дослідження можуть розкрити механізми, що лежать в основі синергетичного ефекту між опроміненням та препаратом, що може мати наслідки для оптимізації протоколів у ЕПТ, а також для розробки та розробки нових хіміотерапевтичних та радіосенсибілізуючих препаратів [14].

Такі сполуки Pt, як цисплатин і карбоплатин, зв'язуються з атомом N7 пуринових основ і продукують аддукти Pt-ДНК, включаючи переважно внутрішньоланцюгові зшивки, міжрядові зшивки та монофункціональне зв'язування з гуаніном [24]. Аддукти спотворюють конформацію ДНК і знижують структурну стабільність ДНК [24, 25]. Більше того, ДНК повинна переносити умови інкубації, необхідні для реакції з сполуками Pt. У більшості досліджень in vitro розчин ДНК змішують з розчином сполук Pt при 37 ° C протягом 24 або 48 годин [26–30]. Ці умови впливають на цілісність ДНК в результаті процесів дедуринації та окислення [31]. Щоб максимізувати кількість сполук Pt, зв’язаних з ДНК, зберігаючи при цьому ДНК цілою, всі параметри, що беруть участь у підготовці плівок, повинні бути відомі та ретельно контролюватися. Зокрема, мають бути визначені експериментальні умови реакції сполук Pt з ДНК, а також вплив хімічного зв’язку сполук Pt на стабільність ДНК.

У цьому дослідженні ми досліджуємо параметри сполук Pt та реакції платинування на цілісність ДНК при приготуванні плівок цисплатин/ДНК та карбоплатин/ДНК. Визначено оптимальні експериментальні умови для збереження високої частки перекрученої форми плазмідної ДНК у плівках Pt-ДНК.

2. Експериментальна секція

2.1. Підготовка плазмідної ДНК

ДНК плазміди (pGEM-3Zf (-), 3197 пар основ, приблизно 1968966 а. М. На плазміду) витягували з Escherichia coli JM109 та очищали набором плазміди HiSpeed Maxi (QIAGEN) [32]. Очищена плазмідна ДНК складалася з 96% суперспіральованих, 2% канкатемерних та 2% круглих форм. Потім розраховували концентрацію ДНК та відносну кількість білків у розчині плазмідної ДНК, вимірюючи співвідношення ультрафіолетового (УФ) поглинання ДНК та білка при 260 нм та 280 нм відповідно за допомогою спектрофотометра Synergy HT-I. Співвідношення становило 1,98, що відповідає чистоті понад 85% [33]. ТЕ-буфер (Tris-EDTA: 10 мМ – 1 мМ) відокремлювали від ДНК гель-фільтрацією із середовищем Sephadex G-50 [34]. Таким чином, кінцевий розчин складався з ДНК і ddH2O після фільтрації. Для оцінки впливу Tris на зв'язування сполук Pt з ДНК були підготовлені дві різні групи розчинів ДНК. У першій групі до розчину ДНК додавали буфер Тріс у співвідношенні однієї молекули трису на нуклеотид, а у другій групі розчин ДНК готували лише з ddH2O. Концентрація ДНК була однаковою в обох групах. У кожній групі контрольні зразки витримували при температурі -20 ° C і визначали кількісно для аналізу температурного впливу на ДНК.

2.2. Платифікація плазмідної ДНК

2.3. Аналіз зв'язування платини і ДНК

Концентрацію платини в розчинах вимірювали методом мас-спектроскопії плазми Elan DRC II з індуктивно зв'язаною плазмою (ICPMS, від Perkin Elmer), яка використовувалася як придатний метод для вимірювання платини у багатьох біомедичних програмах [37, 38]. Крім того, три контрольні зразки, що складаються із сполук Pt, розчинених у ddH2O у відомих концентраціях, також були підготовлені для калібрування вимірювань ICPMS зразків Pt-ДНК. Концентрацію ДНК вимірювали за допомогою спектрофотометрії. Його визначали з оптичної щільності ДНК у розчині, виміряної поглинанням УФ на довжині хвилі 260 нм. Концентрацію ДНК розраховували за еталонною оптичною щільністю.

2.4. Приготування плівки субстрату, ДНК та Pt-ДНК

2.5. Кількісне визначення плівок ДНК та Pt-ДНК

2.6. Статистичний аналіз

Для статистичного та математичного аналізу використовувалось програмне забезпечення OriginPro 8.1 SR1 (OriginLab Corporation). Парним t-критерієм був статистичний тест, в якому ймовірність 0,05 (5%) вважалася значущою.