Відсутність FFAR1GPR40 не захищає мишей від цукрового діабету, викликаного дієтою

Анотація

ЦІЛЬ -FFAR1/GPR40 - це рецептор, пов'язаний з G-білком, експресується переважно в острівцях підшлункової залози, опосередковуючи секрецію інсуліну, викликану вільними жирними кислотами. Однак фізіологічна роль FFAR1 залишається суперечливою. Раніше повідомлялося, що миші-нокаути FFAR1 (Ffar1 -/-) були стійкими до гіперінуслінемії, спричиненої дієтою, гіперглікемії, гіпертригліцеридемії та стеатозу печінки. Більш недавній звіт припускає, що, хоча FFAR1 необхідний для індукованої жирною кислотою секреції інсуліну in vivo, делеція FFAR1 не захищає острівці підшлункової залози від дисфункції острівців, спричиненої жирними кислотами. Це дослідження призначене для дослідження функції FFAR1 in vivo з використанням третьої лінії самостійно генерованих мишей Ffar1 -/- на тлі C57BL/6.

ffar1gpr40

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ -Ми використовували CL-316,243, агоніст адренорецепторів β3, для гострого підвищення рівня вільних жирних кислот у крові та вивчення їх впливу на секрецію інсуліну in vivo. Мишей Ffar1 +/+ (дикого типу) та Ffar1 -/- (нокаут) розміщували на двох різних дієтах з високим вмістом жиру для вивчення їх реакції на ожиріння, спричинене дієтою.

РЕЗУЛЬТАТИ—Секреція інсуліну була зменшена на ~ 50% у мишей Ffar1 -/-, підтверджуючи, що FFAR1 суттєво сприяє стимуляції секреції інсуліну жирними кислотами in vivo. Однак миші Ffar1 +/+ та Ffar1 -/- мали однакову вагу, ожиріння та гіперінсулінемію на дієтах з високим вмістом жиру, а у мишей Ffar1 -/- не спостерігалося покращення тестів на толерантність до глюкози та інсуліну. Крім того, дієта з високим вмістом жиру викликала порівнянні рівні накопичення ліпідів у печінці мишей Ffar1 +/+ та Ffar1 -/-.

ВИСНОВКИ -FFAR1 необхідний для нормальної секреції інсуліну у відповідь на жирні кислоти; однак миші Ffar1 -/- не захищені від індукованої інсуліном резистентності або стеатозу печінки, спричиненого дієтою.

Жирні кислоти беруть участь у різноманітних фізіологічних функціях різних тканин. Вважається, що багато з ефектів жирних кислот опосередковані внутрішньоклітинними метаболітами довголанцюгових ефірів ацил-КоА. Проте за останні кілька років накопичилися докази того, що принаймні деякі види діяльності, що приписуються жирним кислотам, опосередковуються через їх взаємодію з низкою рецепторів, пов'язаних з G-білками, позначеними FFAR1 (GPR40), FFAR2 (GPR43), FFAR3 ( GPR41), GPR120 та GPR84. FFAR2 та FFAR3 активуються коротколанцюговими жирними кислотами, тоді як FFAR1, GPR84 та GPR120 активуються жирними кислотами середнього та довгого ланцюга (1). Серед цих рецепторів FFAR1 та GPR120 звернули увагу на їх потенціал як терапевтичних цілей для метаболічних захворювань (2–4).

Тут ми повідомляємо про метаболічні фенотипи на третій, незалежній лінії мишей Ffar1 -/-, генерованих на фоні C57BL/6Ncrl (B6). Ми виявили, що FFAR1 сприяє приблизно 50% вивільнення інсуліну, зумовленого жирними кислотами, in vivo, що відповідає попередньому звіту Latour et al. (7). На відміну від попередніх спостережень Steneberg et al. (5), однак, наші миші Ffar1 -/- не захищені від негативного впливу дієти з високим вмістом жиру. Миші Ffar1 -/- на дієті з високим вмістом жиру страждали ожирінням, розвивали резистентність до інсуліну та накопичували ліпіди в печінці у подібній мірі порівняно з однокурсниками Ffar1 +/+. У сукупності наші дані підтверджують, що FFAR1 важливий для опосередкованої жирними кислотами секреції інсуліну, але ставлять під сумнів його роль у опосередкуванні токсичного впливу вільних жирних кислот на метаболічні захворювання.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Породження мишей Ffar1 -/- на фоні C57BL/6NCrl (B6).

Мишей Ffar1 -/- генерували на замовлення DeltaGen (Пало-Альто, Каліфорнія). Коротко кажучи, вектор націлювання був розроблений для видалення 152-bp фрагмента, що відповідає позиції 143–294 відкритої рамки зчитування гена Ffar1 (NM_194057). Цей сегмент був замінений касетою з неоміцину (нео). Вектор электропорировали в 129/OlaHsd-похідних клітин ембріонових стовбурів (ES) клітин, а G418-стійкі колонії ES-клітин відібрали та розширили для аналізу ДНК. Правильно націлені клітини ES вводили в бластоцисти для отримання химерних мишей, які потім спаровувались з самками В6. Гетерозиготне потомство Ffar1 (Ffar1 +/-) було виявлено за допомогою стратегії скринінгу на основі ПЛР. ПЛР-праймери були розроблені для виявлення як алелів дикого типу (234 bp), так і нокаутів (399 bp). Послідовності олігонуклеотидів були такими: Ffar1 перед течією видаленої області вперед, 5′-cccagcttggtctacactctccatc-3 ′; Ffar1 нижче за течією віддаленої області реверс, 5′-gatggcttggtacccgaaggggaag-3 ′; та нео вперед, 5′-gggtgggattagataaatgcctgctct-3 ′. Потім мишей Ffar1 +/− схрещували для отримання мишей Ffar1 -/-. Мишей Ffar1 -/- повторно схрещували до мишей C57BL/6NCrl протягом> 10 поколінь, щоб генерувати мишей на тлі B6.

Секреція інсуліну in vivo у відповідь на гостро підвищений вміст вільних жирних кислот.

Мишам Ffar1 +/+ та Ffar1 -/-, які не їли, вік та стать відповідали, отримували інтраперитонеальну ін’єкцію фізіологічного розчину або β3-агоніста CL-316243 (Sigma-Aldrich) у дозі 1 мг/кг (8). Через 15 хвилин після ін’єкції у кожної миші відбирали ∼700 мкл крові шляхом серцевої пункції відразу після задушення СО2. Для збереження глюкагоноподібного пептиду 1 (GLP-1) інгібітор DPP-IV (Linco) додавали в попередньо охолоджені пробірки для збору крові (BD Microtainer 365974; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) та плазму, виділену центрифугуванням при 5000 об/хв протягом 10 хв при підтримці температури 4 ° С. Аликвоти зразків плазми зберігали при -80 ° C до аналізу. Рівні інсуліну та аміду GLP-1 (7-36) у плазмі крові оцінювали за допомогою наборів від Meso Scale Discovery (Гейтерсбург, MD). Рівні лептину, аміліну та глюкагону вимірювали за допомогою наборів Lincoplex Luminex (Linco Research, St. Charles, MO). Глюкозу, вільні жирні кислоти та тригліцериди вимірювали за допомогою комерційних наборів від Wako Diagnostics (Richmond, VA).