Вплив тривалого годування з високим вмістом жиру на експресію ліпаз підшлункової залози та жирової тканини

Катаріна Ріппе

* Відділ клітинної та молекулярної біології, Секція молекулярної сигналізації, Університет Лунда, Лунд, Швеція

Карін Бергер

Jie Mei

Марк Е. Лоу

† Кафедри педіатрії та молекулярної біології та фармакології, Медична школа Вашингтонського університету та Дитяча лікарня Сент-Луїса, Сент-Луїс, Міссурі, США

Шарлотта Ерлансон-Альбертссон

Анотація

Вступ

У короткострокових дослідженнях було показано, що дієта, що містить велику кількість жиру, підвищує експресію панкреатичної ліпази та коліпази.

Дослідити вплив тривалого годування з високим вмістом жиру (113 днів) на експресію мРНК панкреатичної ліпази, коліпази, пов’язаних з панкреатичною ліпазою білків (1 і 2) та роз’єднання білків під час розвитку ожиріння та непереносимості глюкози.

Методологія

Мишей годували або жирною, або звичайною дієтою і вбивали через 3, 13, 57 і 113 днів. Коричневі та білі жирові тканини підшлункової залози збирали для вилучення мРНК.

Результати

Миші з високим вмістом жиру на 113 днів страждали ожирінням та не переносили глюкозу. Дієта з високим вмістом жиру збільшувала ліпазу (p Таблиця 1). Їжа та вода були доступні за бажанням. Шість мишей у кожній групі було вбито на 3-й день, 13-й день, 57-й і 113. день. Біла жирова тканина і коричнева жирова тканина з підшлункової залози були швидко зібрані і негайно заморожені в рідкому азоті.

ТАБЛИЦЯ 1

Вміст макроелементів у дієтах

Зміст Дієта з високим вмістом жиру (г/100 г) Стандартна дієта (г/100 г)

Білок	31	21
Вуглеводи	17	43
Жир	36,9 а	5 б
Енергія (%)
Білок	24	28
Вуглеводи	13	57
Жир	63	15

Толерантність до глюкози

На 0, 57 та 113 день проводили тест на толерантність до глюкози на п’яти мишах з кожної групи, окремо від мишей, що використовувались для збору зразків тканин. Мишей голодували протягом 5 годин (починаючи з 7 до 9 ранку), знеболювали пентобарбіталом натрію (20 мг/кг внутрішньовенно) і вводили внутрішньовенно. з розчином глюкози (1 мг глюкози/г маси тіла). Зразки крові цих мишей відбирали з хвостової вени (15 мкл), і глюкозу негайно вимірювали за допомогою вимірювача глюкози Accutrend (Roche Diagnostics Scandinavia AB, Bromma, Швеція).

Виділення РНК та Норт-блот

РНК виділяли з різних тканин за даними Хомчинського (24). Загалом 20 мкг РНК відокремлювали на 1% агарозному гелі, що містить 2% формальдегіду, і переносили на нейлонову мембрану (Zeta-Probe, Bio-Rad, CA). Прегібридизацію та гібридизацію проводили протягом ночі або при 60 ° C (для зондів ліпази, коліпази та UCP), або при 37 ° C (для зонда 18S). Зонди маркували (α- 32 P) dCTP (Amersham, Pharmacia Biotech, Великобританія) за допомогою набору для перекладу псевдонімів (Roche Diagnostics Gmbh, Мангейм, Німеччина), тоді як зонд 18S маркували кінцем з використанням полінуклеотидної кінази Т4 (Life Technologies AB, Täby, Швеція) та (γ- 32 P) ATP. Фільтри промивали протягом 10 хвилин 0,20 мМ Na2HPO4, 5% SDS, рН 7,2 та 10 хвилин 0,20 мМ Na2HPO4, 1% SDS, pH 7,2. Інтенсивність зв'язаних зондів аналізували за допомогою фосфовізора (Fujix, Bas 2000). Регібридизацію з зондом 18S здійснювали, як описано вище, при 37 ° C. Рівні ліпази, коліпази, PLRP1, PLRP2 та UCP мРНК порівнювали зі стандартом 18S та виражали у довільних одиницях.

Зонди

Зонди для UCP1 та UCP2, а також для ліпази підшлункової залози миші, PLRP1 та PLRP2 були описані раніше (14,19). Зонд 18S рРНК був придбаний у DNA Technology (Данія).

Вестерн-блот

Тканину підшлункової залози від мишей, убитих на 3, 57 і 113 дні, гомогенізували і 10 мкг загального білка наносили на 10% гель SDS-поліакриламіду. Білки переносили в мембрану ProBlott (Applied Biosystems), а білок ліпази виявляли шляхом імунофарбування з використанням поліклональної ліпазної антисироватки, розведеної 1/500 (кроляча анти-свиняча ліпаза, яка розпізнає як панкреатичну ліпазу щурів та мишей) і розвинута з хемолюмінесценцією.

Статистичний аналіз

Толерантність до глюкози. Тест на толерантність до глюкози i.p (1 мг глюкози/г маси тіла) проводили у три різні часові моменти: день 0, день 57 та день 113 (n = 5 у всі моменти часу). Статистична різниця між мишами з високим вмістом жиру та мишами зі стандартним вигодовуванням спостерігалась на 113 день (p Рис. 1A). На противагу цьому, миші, які харчувались жирною дієтою, мали значне збільшення маси тіла (p Рис. 1B). Оскільки існувала взаємодія між дієтою та часом у вазі жирової прокладки епідидиму, було проведено t-тест із корекцією Бонферроні. Цей аналіз показав значимість у кожну часову точку: день 3, p = 0,03; день 13, р = 0,02; день 57, р = 0,04; і день 113, p = 0,01.