Активація каналу TRPV1 дієтичним капсаїцином покращує переробку вісцерального жиру
Анотація
Передумови
Поширеність ожиріння різко зросла у всьому світі і привертає все більшу увагу, але механізм досі незрозумілий. Попередні дослідження показали, що транзиторні рецепторні потенційні канали ванілоїду 1 (TRPV1) беруть участь у втраті ваги шляхом підвищення рівня внутрішньоклітинного Са 2+. Однак потенційний механізм впливу дієтичного капсаїцину на ожиріння до кінця не вивчений. Перенесення Са 2+, індуковане молекулами коннексину43 (Сх43) між зчепленими клітинами, бере участь у диференціації адипоцитів. Чи не викликають TRPV1 зміни в опосередкованому Cx43 спілкуванні адипоцит-адипоцит відіграють роль у ожирінні, невідомо.
Матеріали і методи
Ми досліджували, чи брав участь Cx43 у TRPV1-опосередкованому адипоцитарному ліполізі в культивованих преадипоцитах 3T3-L1 та вісцеральних жирових тканинах людини та мишей дикого типу (WT) та TRPV1-дефіцитних (TRPV1 -/-).
Результати
TRPV1 і Cx43 ко-експресуються в мезентеріальній жировій тканині. Активація TRPV1 капсаїцином збільшувала приплив Са 2+ у преадипоцитах 3T3-L1 та сприяла ліполізу клітин, як показано олійно-червоним фарбуванням O. Ці ефекти були недостатніми при застосуванні капсазепіну, антагоніста TRPV1, та 18 альфа-гліциретинової кислоти (18α-GA), інгібітора розриву. Тривалий хронічний дієтичний капсаїцин знижував вагу периренальної, брижової та яєчкової жирових тканин у мишей, які отримували їжу з високим вмістом жиру. Капсаїцин підвищував рівень експресії p-CaM, Cx43, CaMKII, PPARδ і HSL у мезентеріальних жирових тканинах мишей WT, які годувались жирною дієтою, мишей db/db, а також людей із ожирінням, але ці ефекти капсаїцину відсутні TRPV1 -/- миші. Тривалий хронічний дієтичний капсаїцин знижував масу тіла та ліпіди в сироватці крові мишей WT, але не мишей TRPV1 -/-, які харчувались жирною дієтою.
Висновок
Це дослідження продемонструвало, що активація капсаїцину TRPV1 викликала посилений приплив Са 2+ в опосередкованому Cx43 спілкуванні адипоцит-адипоцит сприяє ліполізу як у пробірці, так і в природних умовах. Активація TRPV1 дієтичним капсаїцином покращує переробку вісцерального жиру завдяки підвищенню регуляції Cx43.
Передумови
Матеріали і методи
Лікування тварин та експериментальні процедури
Суб’єкти Характеристика
Ми набрали осіб із ожирінням чоловіків, і їх класифікували, якщо обхват талії становив більше 90 см відповідно до азіатських критеріїв Регіонального бюро ВООЗ для Західного Тихого океану/Міжнародної асоціації з вивчення ожиріння/Міжнародної робочої групи з питань ожиріння. Отримано вік, індекс маси тіла, обхват талії. Вісцеральні жирові тканини отримували у пацієнтів під час регулярної планової холецистектомії. Холецистектомію довелося робити через симптоматичні камені в жовчному міхурі. Протокол затвердив місцевий комітет з питань етики. Усі випробувані дали письмову інформовану згоду.
Гістопатологічне дослідження
Жирову тканину очищали сольовим розчином і зважували. Вісцеральні жири мишей та людини WT спостерігали за допомогою методів зрізового зрізу та фарбували антитілами проти TRPV1 або Cx43 [20]. TRPV1 та Cx43 в ізольованих преадипоцитах 3T3-L1 або адипоцитах, первинно культивованих з вісцеральної жирової тканини, ідентифікували за допомогою імунофлуоресцентного фарбування. Преадипоцити 3T3-L1 культивували, фіксували та фарбували ліпофільним барвником олійно-червоного О (Sigma-Aldrich). Червоне фарбування показало краплі ліпідів у цитоплазмі, що вказує на кількість крапель ліпідів у преадипоцитах 3T3-L1 відповідно до встановлених методик [26].
Культура клітин та аналіз диференціації адипоцитів
Внутрішньоклітинне вимірювання вільного кальцію
Клітини 3T3-L1, вирощені на скляних кришках, завантажували індикатором Ca 2+ Fura-2 (2 мкмоль/л, Invitrogen, Пейслі, Великобританія) та 0,025% Pluronic F-127 у фізіологічному сольовому розчині протягом 40 хв при кімнатній температурі в темно. [Ca 2+] i вимірювали за допомогою флуоресцентного зчитувача пластин (Varioskan Flash, Thermo) при випромінюванні 510 нм з довжинами хвиль збудження 340 нм та 380 нм. Зміни в [Ca 2+] i були розраховані з коефіцієнтів перехідного збільшення інтенсивності флуоресценції при 340 нм та 380 нм [8].
Відновлення флуоресценції після фотовідбілювання (FRAP)
Імуноблоттинговий аналіз
Імуноблотинг TRPV1, Cx43, p-CaM, CaMKII, PPARδ, HSL, β-актину та GAPDH проводили із застосуванням стандартних методик для жирової тканини та зрілих жирових клітин. Первинне антитіло до TRPV1 було придбано в Аломоне, Ізраїль, а інші первинні антитіла - у компанії Santa Cruz Biotechnology (Санта-Крус, Каліфорнія, США). Після інкубації з вторинними антитілами протягом 1 год білки виявляли за допомогою посиленої хемілюмінесценції та кількісно визначали за допомогою геля Doc 2000 Imager (Bio-Rad).
Вимірювання тригліцеридів та вільних жирних кислот у клітинах
Загальні ліпіди екстрагували з преадипоцитів 3T3-L1 із застосуванням суміші хлороформ-метанол (2: 1, об./Об.). Кількісний вміст тригліцеридів та вільних жирних кислот визначали за допомогою набору ELISA (Applygen Technologies Inc., Китай) відповідно до інструкцій виробника. Клітинні екстракти збирали і центрифугували зі швидкістю 10000 об/хв протягом 15 хв для отримання супернатанту. Потім 100 мкл супернатанту та 50 мкл ферментного кон’югату додавали до забезпеченого 96-лункового планшета протягом 1 год при 37 ° С, тоді як стандартну криву робили в тій же пластині. Потім кожну лунку промивали 5 разів розведеним промивним розчином, ретельно висушуючи абсорбуючим папером. Потім послідовно додавали 50 мкл субстрату A і 50 мкл субстрату B і планшет інкубували при 37 ° C протягом 15 хв. Нарешті, в кожну лунку додавали стоп-розчин 50 мкл і вимірювали значення OD450 за допомогою Varioskan Flash, Thermo.
Статистичний аналіз
Дані виражали як середнє значення ± SEM від трьох до 3-15 незалежних експериментів або мишей. Порівняння між групами аналізували за допомогою Стьюдента т тест або односторонній ANOVA за допомогою багаторазового порівняльного тесту Бонферроні (GraphPad Prism; La Jolla, CA, USA). Двохвостий стор значення менше 0,05 вважали статистичною значимістю.