Активність Елафіну проти ВІЛ-1 залежить від його ядерної локалізації та зміни вродженого імунітету

Анна Григорівна Дранник

1 Кафедра патології та молекулярної медицини, Центр імунології Макмастера, Інститут досліджень інфекційних хвороб імені Майкла Г. ДеГрута, Університет Макмастера, Гамільтон, Онтаріо, Канада,

Какон Наг

Сяо-Дан Яо

1 Кафедра патології та молекулярної медицини, Іммунологічний науковий центр Макмастера, Інститут досліджень інфекційних хвороб імені Майкла Г. ДеГрута, Університет Макмастера, Гамільтон, Онтаріо, Канада,

Бетані М. Генрік

Т. Блейк Болл

2 Кафедра медичної мікробіології, Університет Манітоби та Агентство охорони здоров'я Канади, Вінніпег, Манітоба, Канада,

Френсіс А. Пламмер

Чарльз Вачіхі

3 Кафедра медичної мікробіології Університету Найробі, Найробі, Кенія,

Джошуа Кімані

3 Кафедра медичної мікробіології Університету Найробі, Найробі, Кенія,

Кеннет Л. Розенталь

Задумав і спроектував експерименти: AGD KN KLR. Виконував експерименти: AGD. Проаналізовано дані: AGD KN X-DY. Внесені реагенти/матеріали/інструменти для аналізу: KN X-DY BMH TBB FP CW JK. Написав папір: AGD KN KLR.

Анотація

Вступ

Tr і E (Tr/E) є тривожними антипротеазами та регуляторами слизової оболонки імунітету з добре задокументованими антимікробними, імуномодулюючими та тканинними відновлювальними властивостями [23], [24]. Tr/E є членами сімейства сироваткових білків (WAP), які містять характерне та еволюційно збережене чотиридисульфідне ядро (FDC) або домен WAP, що бере участь у інгібуванні протеази [25], [26]. Tr (9,9 кДа) - це молекула-попередник, що секретується, яка має два домени. Tr у своєму N-кінцевому домені містить трансглутаміназний субстрат-зв’язуючий домен (TSBD), що дозволяє зв’язувати Tr з білками позаклітинного матриксу [27]. Протеолітичне розщеплення N-кінця Tr утворює елафін (Е) (5,9 кДа), що містить інгібуючий домен WAP [28] і один TSBD [29].

Як і їх структурний гомолог, секреторний інгібітор лейкоцитарної протеази (SLPI) [26], Tr/E володіє антимікробною активністю щодо бактерій, грибків та вірусів, включаючи ВІЛ-1 [11], [23], [30], [31] . Запропоновано декілька механізмів антимікробної активності Tr/E, включаючи їх безпосередню взаємодію з клітинною мембраною клітин через катіонну природу цих молекул [31], бактеріальну опсонізацію [32] та зв'язування з ДНК бактерій [33]. Також було показано, що Tr/E мають імуномодулюючі властивості [24]. Було показано, що Е інгібує LPS-ініційоване вивільнення MCP-1 у моноцитах [34], тоді як Tr/E зменшує секрецію IL-8 і TNFα у відповідь на людську еластазу, LPS та окислений LDL в ендотеліальних клітинах та макрофагах TNF [35]., [36]. Ця імуномодуляція пояснюється зв'язуванням з LPS [35] або пригніченням активації шляхів NF-κB та AP-1 [34],. Ці висновки демонструють плейотропну природу Tr/E та їхній внесок у захист господаря на диференціальних рівнях: націлювання як на патогени, так і на імуно-запальні реакції господаря.

Tr/E також пов'язані із запальними розладами легенів [37], [38], кишечника [39] та шкіри [25]. Tr/E конститутивно експресуються у слизовій секреції [9], [11] і можуть бути індуковані у відповідь на IL-1β, TNFα та polyI: C [3], [11], [40]. Tr/E виробляються різними типами клітин, включаючи ГК статевих органів [3], [11], [40], і їх було виявлено в рідині цервікально-піхвового промивання (CVL) [22], [30]. Вважається, що Tr/E разом із SLPI та безліччю інших ефекторних молекул, а саме дефензинами, серпінами, цистатинами, лізоцимом та лактоферином, відіграють значну роль у захисті FGT від ІПСШ, включаючи ВІЛ-1 [9], [11] ], [12], [30], [41], [42].

Матеріали і методи

Реактиви та клітинні лінії

Поліінозинову/поліцитидилову кислоту (polyI: C) (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Канада) відновлювали в PBS при зазначеній концентрації. Карцинома ендометрія людини (HEC-1A, ATCC # HTB-112 ™, депонована доктором Х. Курамото) і TZM-bl (JC53-BL) (ATCC # PTA-5659, номер патенту США 6 797 462, внесений доктором Джоном Каппесом і Xiaoyun Wu) клітини були отримані з American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA) та підтримувались у середовищі McAy's 5A Medium Modified (Invitrogen Life Technologies, Берлінгтон, Онтаріо, Канада) та DMEM, відповідно, доповнених 10% плодом бичача сироватка, 1% HEPES (Invitrogen Life Technologies), 1% l-глутаміну (Invitrogen Life Technologies) та 1% пеніцилін-стрептоміцину (Sigma-Aldrich, Oakville, Онтаріо, Канада) при 37 ° C при 5% CO2.

Аналіз інгібування протеази

Інгібуючу еластазу активність вимірювали, як описано раніше [30], [43]. Коротко кажучи, білок Tr/E (кінцевий об'єм 10 мкл/лунка), або лише розчинник, поєднували в 96-лунковому планшеті з 50 нг в 10 мкл/лунку очищеної нейтрофільної еластази людини (HNE) (Sigma-Aldrich) або розчинника окремо (негативний контроль) та інкубують протягом 30 хв при 37 ° С. Згодом 50 мкл субстрату HNE, N-метоксисукциніл-Ала-Ала-Про-Вал п-нітроанілід (Sigma-Aldrich), розведений до 50 мкг/мл в буфері (50 мМ Трис, 0,1% Тритон, 0,5 М хлорид натрію, рН 8). Гідроліз вимірювали, контролюючи поглинання при 405 нм протягом 15 хв, використовуючи зчитувач ELISA Tecan Safire (MTX Labs Systems).

Учасники дослідження

Учасники дослідження були більш детально описані в іншому місці [30]. Коротко кажучи, жінки, які перебувають у когорті ЖКС Пумвані з Найробі, Кенія, були зараховані під час планових дворічних опитувань у дві дослідницькі групи: ВІЛ-Р, ВІЛ-С. Це постійна відкрита когорта з учасниками, записаними між 1989 і 2009 роками. У цій когорті жінки, які залишались ВІЛ-негативними протягом 7 років спостереження, як оцінювали як серологія, так і RT-PCR, і які були клінічно здоровими та вільними супутніх інфекцій, що передаються статевим шляхом (ІПСШ), а також залишалися активними у секс-роботі вважалися відносно ВІЛ-резистентними ВІЛ-R [44] _. Учасники, які були ВІЛ-неінфікованими ЖКС, але за якими спостерігали менше 7 років, були визначені як ВІЛ-S. Усі учасники когорти мали подібний соціально-економічний та генетичний фон. Жодні ЖКС, які брали участь у цьому дослідженні, не мали спільних ІПСШ. Протоколи дослідження були схвалені комісіями з розгляду етики в університетах Найробі, Манітоби та Макмастера. Усі учасники надали підписану, інформовану згоду.