Дефіцит Per-Arnt-Sim кінази (PASK) збільшує клітинне дихання за звичайної дієти та

Дженні А. Папе

Колін Р. Ньюї

Хейлі Р. Беррелл

Одрі Воркман

Кетлін Перрі

2 Кафедра фізіології та біології розвитку Університету Бригама Янга, Прово, UT 84602, США; [email protected] (К.П.); ude.uyb@namkib_nimajneb (B.T.B.)

Бенджамін Т. Бікман

Лора С. Бріджуотер

Джуліанна Х. Гроуз

Пов’язані дані

Анотація

1. Вступ

Цукровий діабет та пов'язаний із цим захворюванням метаболічний синдром є постійно зростаючою епідемією в сучасному суспільстві. У 2015 році 9,4% населення Сполучених Штатів страждали на діабет, і оцінка метаболічного синдрому була набагато вищою - 30% [1,2,3]. Характеризуючись поєднанням підвищеного кров’яного тиску, високого рівня цукру в крові, надлишку жиру в тілі навколо талії та ненормального рівня тригліцеридів, метаболічний синдром підвищує ризик серцево-судинних захворювань, інсульту та діабету [1]. Збільшення частоти цих захворювань частково зумовлене глобальним переходом на енергетично щільну їжу з високим вмістом жиру та з низьким вмістом поживних речовин у поєднанні зі зниженням фізичної активності [4]. Оскільки ці зміни впливають на організм в цілому, вони також кидають виклик клітинним процесам в організмі, коли він намагається адаптуватися до нових рівнів поживних речовин та активності. Датчики поживних речовин відіграють вирішальну роль у адаптації до цих нових рівнів, постійно контролюючи клітинні поживні речовини та регулюючи клітинні шляхи для підтримання гомеостазу [5,6]. Коли відбувається порушення регуляції шляхів зондування поживних речовин, розвивається багато захворювань людини, таких як діабет та метаболічний синдром.

Тут ми характеризуємо молекулярний вплив PAS-кінази на дихання та метаболізм тригліцеридів, а також те, як PAS-кіназа змінює ці шляхи у відповідь на дієту та стать. У цьому дослідженні використовувались аналізи клітинного дихання, вестерн-блот-аналізи щодо вмісту білка в ланцюзі транспортного ланцюга та підходи до метаболоміки тригліцеридів. Щоб визначити вплив дієти на мишей PASK -/-, ми досліджували додавання цукру до ранішньої ВЧ-дієти (дієта з високим вмістом жиру з високим вмістом цукру, дієта HFHS). Ця дієта забезпечує умови, коли PAS-кіназа може бути більш активною (з високим вмістом цукру), а також більш точно відображає західний раціон сучасного суспільства (з високим вмістом цукру та високим вмістом жиру [22]). Крім того, ми розглядаємо стать (самки проти самців мишей), характеризуючи молекулярні ефекти PAS-кінази, про що раніше не повідомлялося. Ці результати допоможуть зрозуміти вплив PAS-кінази, а також дієти HFHS на обмін речовин, проливаючи світло на шляхи, що сприяють таким захворюванням, як метаболічний синдром та діабет.

2. Матеріали та методи

Тварини: C57BL/6 (Charles River Laboratories, Вілмінгтон, Массачусетс, США) PASK -/- миші щедро пожертвував Джаред Руттер (Університет штату Юта) і були описані раніше [18]. Дикий тип C57BL/6 був отриманий з лабораторій Charles River Wilmington, MA. Зіставлені за віком самці та самки дикого типу та миші PASK -/-, створені розведенням мишей PASK +/−, були поміщені на дієту HFHS (D12266Bi Condensed Milk Diet from Research Diets - 16,8% ккал білка, 31,8% ккал жиру, 51,4 % ккал вуглеводів - переважно сахароза, молочно-казеїновий та кукурудзяний крохмаль) або звичайна дієта чау (NC) (дієта для гризунів Teklad 8604 від Envigo - 32% білка, 14% жиру, 54% вуглеводів - переважно очищена соєва мука) у віці 12 тижнів і витримується на дієті загалом 25 тижнів. Мишей утримували не більше 5 мишей/клітку відповідно до статі, генотипу та призначеного раціону в звичайному будинку для тварин. Їжа та вода були у вільному доступі, а миші проходили 12-годинний цикл світло/темрява. Усі процедури були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин університету Бригама Янга (протоколи No 13-1003, подані L.C.B.).

Дизайн дослідження: Дизайн базувався на характеристиці мишей PASK -/- самців на ВЧ-дієті, де мишей садили на ВЧ-дієту через 12 тижнів, а 12–24 мишей кожної групи використовували для отримання статистичної значущості кількох фенотипів включаючи масу тіла [18]. У цьому дослідженні представлено 8 експериментальних груп, включаючи чоловічу та жіночу дієти з нешкідливим станом, дієту з високим рівнем здоров’я з високим рівнем здоров'я, дієту з PASK +/− NC, дієту з PASK +/− HFHS, які тримали на дієті HFHS протягом 25 тижнів до збирання тканин. Більше мишей, ніж самки, було потрібно через обмеженість тканин (наприклад, тканини печінки для аналізу тригліцеридів проти аналізу споживання кисню). Опис усіх тварин, які використовувались у цьому дослідженні, наведено на малюнку S1.

Аналізи дихання: Збирали тканину печінки та м’яз підошви та негайно використовували для аналізів дихання. Споживання O2 визначали за допомогою оксиграфа O2K (Oroboros Instruments Corp, Інсбрук, Австрія), як описано раніше [23]. Тканини подрібнювали скальпелем і просочували сапоніном (50 мкг/мл). Вихідну частоту дихання визначали у кожній дихальній камері, а потім додавали зразки. Дихання вимірювали, дотримуючись протоколу субстрат-роз'єднувач-інгібітор-титрування (SUIT): глутамат, малат та сукцинат (GMS) додавали для оцінки електронного потоку комплексу I та II. Потім додавали ADP (2,5 мМ) для визначення здатності до окисного фосфорилювання (GMSD). Після збору даних було проведено трифакторний дисперсійний аналіз (ANOVA) із використанням програмного забезпечення JMP Pro14 з пост-хок-тестом Тукі для трифакторного та двофакторного порівнянь та студентського тесту для однофакторного порівняння.

Аналізи тригліцеридів: Зразки печінки миші гомогенізували у 110 мкл PBS-Тритону. Рівні тригліцеридів у печінці вимірювали за допомогою колориметричного/флуорометричного набору тригліцеридів BioVision (Milpitas, Каліфорнія, США) згідно з протоколом виробника, а поглинання вимірювали при 530–590 нм. Концентрацію білка визначали за допомогою реагенту для аналізу Pierce Coomassie Plus (Bradford) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). Трифакторну ANOVA проводили з використанням програмного забезпечення JMP Pro14 з пост-хок-тестом Тукі для трифакторного та двофакторного аналізу взаємодії та студентським тестом для однофакторного аналізу.

Статистичний аналіз: Протягом усього дослідження для аналізу впливу статі, генотипу та дієти використовували трифакторну ANOVA із зазначенням конкретних відмінностей для кожного методу. Там, де використовувались лише миші-самці, для аналізу ефекту генотипу та дієти використовували двофакторну ANOVA. Факторна ANOVA проводилась із використанням програмного забезпечення JMP Pro14 (версія 14.0) з пост-хок-тестом Тукі, що використовується для трифакторного (стать, генотип та дієта) та двофакторного (стать та генотип, стать та дієта, генотип та дієта) студентський t-тест, що використовується для однофакторного (статі, генотипу чи дієти) аналізу. Аналіз сукупних факторів позначається знаком "*". Наприклад, "секс і генотип" пишеться як секс * генотип.

3. Результати

3.1. Миші, дефіцитні PAS-кіназою, виявляють посилене дихання, перебуваючи на звичайній дієті чау (NC)

Попередні дослідження повідомляли про гіперметаболічний фенотип для мишей PASK -/-, які харчуються ВЧ-дієтою, включаючи збільшення споживання O2 у цілих тварин та виведення СО2 [9]. Цей фенотип може бути обумовлений посиленим диханням у периферичних тканинах. Отже, ми вимірювали клітинну норму споживання кисню в жіночому та чоловічому підошві, м’язі, в основному складеному з повільних окисних волокон, а також у тканинах печінки жінки та чоловіки (рис. 1). Тканина підошви як жіночих, так і чоловічих мишей PASK -/- демонструвала тенденційне збільшення частоти базального дихання на NC дієті порівняно з мишами WT під час трифакторного аналізу (стать, дієта, генотип). Двофакторний та однофакторний аналіз використовувались для визначення того, чи якісь фактори суттєво сприяли цьому тенденційному зростанню. Двофакторний аналіз із використанням комбінованих факторів, таких як стать та генотип (стать * генотип, стать * дієта або генотип * дієта), не виявив суттєвої взаємодії факторів, але подальший однофакторний аналіз показав, що головним відповідальним є генотип PASK -/для значно посилення дихання (a