Дієта, багата сахарозою, викликає мутації у дослідженнях раку товстої кишки щурів
Анотація
ВСТУП
Композиція корму для тварин у чотирьох дозових групах
Окислений білок і MDA. 2
Близько 0,3 г подрібненої печінки гомогенізували протягом 10 с за допомогою гомогенізатора Ultra-Turrax T25 (Janke Kunkel GMBH, Штауфен, Німеччина) в 3 мл 0,25 м сахарози і центрифугували при 9000 × g, а цитозольну фракцію отримували осадженням кальцію (18). Фракції плазми та цитозолю з печінки аналізували на окислені залишки лізину (AAS) та на окислені залишки проліну або аргініну (γ-глутамілсеміальдегід) у білках, як описано Daneshvar та співавт. (19). Білок визначали на аналізаторі Cobas Mira + за допомогою комерційного набору (номер каталогу 0736783; Roche, Базель, Швейцарія).
Загальний MDA у плазмі визначали методом ВЕРХ, як описано Лаурідсеном та Мортенсеном (20) .
Антиоксидантні ферменти.
Автоматизовані аналізи антиоксидантних ферментів SOD, GPx, CAT та GR у лізованих еритроцитах проводили на аналізаторі Cobas Mira. SOD (каталожний номер Randox SD 125) та гемоглобін (каталожний номер Randox HG 980) визначали за допомогою комерційно доступних наборів, тоді як активність GR визначали методом Голдберга та Спонера (21). Активність GPx, використовуючи трет-бутилгідропероксид як ініціатор, та активність CAT визначали згідно з методом, описаним Wheeler et al. (22). Ферментативну активність в еритроцитах розраховували щодо кількості гемоглобіну.
Вітамін С у плазмі та печінці.
Плазму (200 мкл) та гомогенат печінки (300 мг) негайно обробляли метафосфорною кислотою, як описано раніше, і зберігали максимум 3 місяці при -80 ° C перед аналізом ВЕРХ на аскорбат та дегідроаскорбат (23) .
Ізоляція клітин з печінки і ободової оболонки.
Виділення клітин печінки по суті проводили, як описано раніше (24). Клітини слизової оболонки товстої кишки зішкребали з розморожених шматочків товстої кишки скляним предметним склом мікроскопа і поміщали в крижаний розчин Merchant-EDTA [0,14 м NaCl, 1,47 мм KH2HPO4, 2,7 мм KCl, 8,1 мм Na2HPO4, 10 мм NaH2PO4 та 10 мм NaEDTA (рН 7,4); Посилання 25] .
Аналіз мутацій.
Клітини товстої кишки та печінки суспендували у 2 мл Merchant-EDTA шляхом піпетування вгору та вниз тричі. Близько 20 мільйонів клітин фільтрували через ситечко для клітин (Falcon; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), а ДНК очищали набором для ізоляції ДНК RecoverEase (Stratagene, La Jolla, CA). ДНК із приблизно 60 мг замороженої печінки готували RecoverEase, як описано виробником (Stratagene). Препарат ДНК (8 мкл) упаковували з екстрактом упаковки Transpack (Stratagene). Якщо пакувальна суміш була в’язкою після рекомендованого стандартного часу пакування 180 хв, суміш інкубували ще 60 хв. Якщо суміш після цього часу все ще була в’язкою, додавали додаткові реагенти Transpack, і суміш інкубували ще 60 хв. Цей фаговий препарат був використаний для зараження кишкової палички G1250 (hfl -). Фаги з мутаціями в локусі cII ідентифікували шляхом утворення нальоту в селективних умовах росту при 24 ° C, а загальну кількість інфекційних фагів визначали утворенням бляшок в неселективних умовах росту при 37 ° C, як описано (λ Select-cII ™ Mutation Система виявлення великих блакитних гризунів; Stratagene).
Аналіз SCGE.
Виявлення пошкодження ДНК в одиничних клітинах печінки та товстої кишки проводили, як описано раніше (24). Рівень чутливих до EndoIII сайтів був отриманий як різниця в балах паралельних предметних стекол, інкубованих із ферментами EndoIII та без них при 37 ° C протягом 45 хв [фермент EndoIII був своєрідним подарунком від Сержа Бойте (UMR217 Center National de la Recherche Scientifique et Commissariat a l'Energie Atomique, Fontenay aux Roses, Франція)]. Для кожного зразка було відібрано 50 зображень за допомогою програмної системи Kinetics Imaging Limited (Ліверпуль, Великобританія) Версії 4 для визначення кількості ДНК, яка мігрувала від голови комети до хвоста.
Виявлення 8-oxodG.
Рівні 8-oxodG щодо дезоксигуанозину вимірювали в клітинах слизової оболонки товстої кишки та печінки за допомогою ВЕРХ з електрохімічним виявленням після виділення та перетравлення ядерної ДНК, як описано в інших роботах (26). Концентрації 8-oxodG у сечі вимірювали за допомогою ВЕРХ із тандемною мас-спектрометрією, як описано в інших місцях (27) .
32 P Аналіз після маркування.
ДНК екстрагували з подрібненої печінки та клітин слизової оболонки товстої кишки за допомогою стандартної процедури екстракції фенолом/хлороформом, і аналіз після маркування 32 P проводили, як описано раніше (28), використовуючи екстракцію бутанолу як процедуру збагачення. Стандарт, що складається із модифікованої бензо (а) пірен-діол-епоксид-модифікованою пірео-епоксидом ДНК тимусу теляти, використовувався для корекції повсякденних змін у аналізі. Результати виражаються як аддукти/10 8 нуклеотидів, виходячи із середнього значення двох незалежних аналізів.
Кількісна оцінка rERCC1 і rOGG1 Рівні мРНК у товстій кишці та печінці.
Загальну РНК очищали від 10 мг печінки або від 5 × 10 6 клітин товстої кишки за допомогою набору для очищення загальної РНК Qiagen, як рекомендовано виробником. РНК обробляли ДНКазою, як рекомендував Qiagen. Подальший контроль якості показав, що всі геномні забруднення були видалені обробкою ДНКазою. Цілісність РНК перевіряли за допомогою гель-електрофорезу, як описано раніше (29). РНК (200 нг) використовували для синтезу кДНК в реакційному обсязі 10 мкл, використовуючи комплект зворотної транскрипції-ПЛР Taqman Gold, як рекомендували PE Biosystems. Для кількісної оцінки рівнів мРНК використовували зонди Такмана. Для rERCC1 використовували такі олігонуклеотиди: (a) прямий праймер (53F), 5′-cctgggaaggacgaggaaa-3 ′; (b) зворотний праймер (121R), 5′-tgggataacaaacttcttcctggt-3 ′; та (c) зонд Такмана (74T), 5′-FAM-cggccacagccctcaggacc-TAMRA-3 ′ (TAGCopenhagen). Для rOGG1 використовували такі олігонуклеотиди: (а) зонд Такмана, 5′-FAM-TCATGCCCTGGCTGGTCCAGAAG-TAMRA-3 ′; (b) прямий праймер, 5′-ACTTATCATGGCTTCCCAAACC-3 ′; та (c) зворотний праймер, 5′-CAACTTCCTGAGGTGGGTCTCT-3 ′. Цей зонд не є специфічним для OGG1 щурів і, ймовірно, виявляє як ядерну, так і мітохондріальну мРНК OGG1 у різних видів.
Реакції ПЛР проводили в двох примірниках або в трьох примірниках в системі виявлення послідовностей ABI 7700 в реакціях 15 мкл, що містять 200 нм праймерів, 300 н м зонд Такмана та 0,1 мкл кДНК в 1 × Mastermix (PE Biosystems). Для нормалізації 18S мРНК визначали кількісно в окремій реакції ПЛР, використовуючи попередньо розроблений аналітичний реагент для ендогенного контролю для кількісного визначення 18S РНК (PE Biosystems) у двох або трьох примірниках. Для кожної тварини середнє значення кількісних показників rERCC1 ділили на середнє значення кількісних характеристик 18S РНК.