Дієта з високим вмістом жиру та високим вмістом холестерину призводить до стеатозу печінки у личинок даніо - нова модель для
Анотація
Передумови
Зростає поширеність неалкогольної жирової хвороби печінки (НАЖХП), що характеризується як надмірне накопичення ліпідів у гепатоцитах. Експлуатація ефективних препаратів проти НАЖХП виявилася складною. Тут ми прагнули створити дієтичну модель стеатозу печінки з використанням прозорих личинок даніо, в яких можна було б проводити високопродуктивні хімічні екрани.
Методи
Личинок даніо, яких годували дієтою з високим вмістом жиру (HF) та дієтою з високим вмістом жиру та високим вмістом холестерину (HFC), порівнювали з контролем. Ми проаналізували внутрішньопечінкове накопичення ліпідів, біологічні показники та різні шляхи, включаючи метаболізм ліпідів, стрес та запалення ЕР. Крім того, оцінювали вплив езетимібу та симвастатину на індукований дієтою HFC стеатоз.
Результати
Висновок
Отримані нами результати демонструють, що модель стеатозу личинок даніо, створена та підтверджена в цьому дослідженні, може бути використана для в природних умовах дослідження стеатозу та скринінг наркотиків.
Вступ
Безалкогольна жирова хвороба печінки (НАЖХП) є найпоширенішою причиною дисфункції печінки людини і має величезний ризик для здоров'я людини [1]. За підрахунками, близько 20% -30% загальної популяції страждає простим стеатозом, а поширеність безалкогольного стеатогепатиту (NASH) становить 3% -10% [2]. Блокування стеатозу печінки має вирішальне значення для запобігання розвитку НАЖХП. Незважаючи на те, що внаслідок зміни способу життя та застосування добавок відбулися покращення прогресування печінкового стеатозу до більш поглибленого запалення печінки [3, 4], патогенез НАЖХП залишається незрозумілим, а терапевтичні препарати все ще обмежені.
Методи
Догляд і годування даніо
Ембріони плям АВ дикого типу підтримували відповідно до стандартного протоколу [32]. Личинок даніо годували з контрольною дієтою (Zeigler Bros, Inc., США. Білки: 50%, жири: 12%, клітковина: 2,5%), ВЧ дієта (Marine Biological Science Co, LTD of CNSIC, Тяньцзінь, Китай. Білок: 50%, жири: 24%, клітковина: 2,5%) та дієта з ГФУ (2,5% та 5,0% мас./Мас. Холестерину додається до ВЧ дієти, як описано [33]). Це дослідження було схвалено Комітетом з догляду за тваринами та використання Південного медичного університету, Гуанчжоу, і було докладено всіх зусиль для мінімізації страждань.
Лікування
Для оптимізації протоколу впливу личинок на дієти HF та HFC, ми спочатку оцінили споживання контрольної дієти личинками даніо. Ми годували 100 личинок у 2-літровому резервуарі з 30 мг-180 мг на день, щоб задовольнити їх основну енергетичну потребу. Ми виявили, що частота стеатозу у личинок даніо поступово зростала із збільшенням кількості годування. Виходячи з цих результатів, всі типи дієт для личинок були суворо обмежені - 30 мг/цистерну на день. Езетиміб (Санта Круз Біотехнологія, штат Техас, США), використаний у цьому дослідженні, додавали безпосередньо до води в рибному резервуарі з концентрацією 1 мкМ, а симвастатин (Cayman Chemicals, Мічиган, США) додавали при 50 μг/г їжі. Ці концентрації ліків та способи введення були обрані на основі попереднього звіту, як описано [34].
Цільне кріплення олійного червоного фарбування O
Личинки даніо голодували протягом 24 годин після годування. Потім личинки фіксували у 4% параформальдегіді (PFA) протягом ночі при 4 ° C і двічі промивали забуференним фосфатом фізіологічним розчином (PBS), інфільтрували 80% та 100% 1,2 пропіленгліколем при кімнатній температурі 20 хвилин відповідно і фарбували 0,5% олійно-червоного O (Кат. No O0625, Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, США) у 100% 1,2 пропіленгліколі в темряві протягом ночі при кімнатній температурі. Забарвлені личинки промивали PBS і вицвітали фоновий колір промиванням 100% і 80% 1,2 пропіленгліколю протягом 30 хв кожну і зберігали у 80% 1,2 пропіленгліколю при 4 ° C. Краплі ліпідів у тканині печінки спостерігали та зображали на розсікаючому мікроскопі яскравого поля (Olympus szx10, Tokoyo, Японія). Личинки були визначені позитивними на стеатоз, якщо межа між печінкою та навколишніми тканинами є чіткою, а 3 або більше крапель ліпідів видно в печінці за допомогою фарбування олійного червоного кольору O.
Олійно-червоне O фарбування кріосекцій
Личинки фіксували в 4% PFA протягом ночі при 4 ° C і інфільтрували 30% сахарози протягом ночі при 4 ° C. Личинки були вбудовані в суміш тканин OCT Tissue-Tek (Sakura Japan Co., Ltd., Токіо, Японія), а ділянки розміром 10 мкм встановлювали на предметні стекла та зберігали в - 80 ° C. Перед фарбуванням олійно-червоним O, предметні стекла нагрівали до кімнатної температури і занурювали у 85% та 100% 1,2 пропіленгліколю на 5 хв кожне, а потім фарбували олійно-червоним O в темряві протягом ночі при кімнатній температурі. На наступний день предметні стекла швидко забарвлювали у 100% та 85% пропіленгліколі, а потім промивали PBS для очищення фону. Слайди візуалізували на мікроскопі Olympus BX51.
Біологічний аналіз
Печінку 50-70 личинок даніо гомогенізували в буфері для лізису, центрифугували і отримували надосадову рідину. FC, TC і TG в гомогенатах печінки вимірювали за допомогою наборів (APPLYGEN Bioengineering, Пекін, Китай та Nanjing Jiancheng Bioengineering, місто Нанкін, Китай), дотримуючись інструкцій виробника, і нормалізували загальну концентрацію білка, визначену Бредфордом ( Bio-Rad, Геркулес, Каліфорнія).
Гістологічний аналіз
Личинки фіксували 4% PFA протягом ночі, закладаючи їх у парафін відповідно до стандартних процедур. Зрізи чотирьох мкм фарбували гематоксиліном та еозином (H&E) та спостерігали на мікроскопі BX51 (Олімп, Токіо, Японія).
Кількісна RT-PCR
Загальну РНК витягували з пулів 20-30 розсічених печінок та очищали за допомогою міні-набору RNeasy plus (Qiagen, німецька) та зворотну транскрипцію з кДНК qScript з використанням набору PrimeScript ™ RT-PCR (Takara Biotechnology Co., Ltd., Далянь, Китай ). Кількісну ПЛР із зворотною транскрипцією (qRT-PCR) проводили на Light Cycler 480 (Рош, Базель, Швейцарія) з використанням генно-специфічних праймерів (Додатковий файл 1: Таблиця S1). eef1a1 було використано в якості еталону, а вираження вираховували за методом порогу циклу (Ct) (2 -Ct (ціль)/2 -Ct (eef1a1)).