Дієтичні сполуки калангін та мірицетин пригнічують ангіогенез ракових клітин яєчників
Хайджі Хуан
1 Коледж інженерії біосистем та харчових наук, Інститут харчових наук ім. Фулі, Університет Чжецзян, Китай
2 Коледж наук, технологій та математики, Університет Олдерсона Броддуса, Філіппі, штат Вірджинія, 26416, США
Аллен Ю. Чень
3 Департамент фармацевтичної науки Університету Західної Вірджинії, Моргантаун, штат Вірджинія 26506, США
Йон Роджанасакул
3 Департамент фармацевтичної науки Університету Західної Вірджинії, Моргантаун, штат Вірджинія 26506, США
Сінцянь Є
1 Коледж інженерії біосистем та харчових наук, Інститут харчових наук ім. Фулі, Університет Чжецзян, Китай
Гері О. Ранкін
4 Кафедра фармакології, фізіології та токсикології, Медична школа Джоан К. Едвардс, Університет Маршалла, Хантінгтон, штат Вірджинія, 25755, США
І Чарлі Чен
2 Коледж наук, технологій та математики, Університет Олдерсона Броддуса, Філіппі, штат Вірджинія, 26416, США
Анотація
Галангін та міріцетин - це флавоноїди, виділені з овочів та фруктів, які проявляють антипроліферативну активність у ракових клітинах людини. У цьому дослідженні їх антиангіогенні ефекти досліджували за допомогою моделей in vitro (HUVEC) та in vivo (CAM), які показали, що галангін та мірицетин інгібують ангіогенез, індукований клітинами OVCAR-3. Були також вивчені молекулярні механізми, за допомогою яких галангін та мірицетин пригнічують ангіогенез. Було помічено, що галангін та мірицетин пригнічують секрецію ключового медіатора ангіогенезу фактора росту судинного ендотелію (VEGF) та знижують рівні білків p-Akt, p-70S6K та індукованого гіпоксією фактора-1α (HIF-1α) у A2780/CP70 та Клітини OVCAR-3. Експерименти з транзиторною трансфекцією показали, що галангін та мірицетин пригнічують секрецію VEGF шляхом Akt/p70S6K/HIF-1α. Більше того, було виявлено, що новий шлях, p21/HIF-1α/VEGF, бере участь у інгібуючій дії мірицетину на ангіогенез у клітинах OVCAR-3. Ці дані свідчать про те, що галангін та мірицетин можуть служити потенційними антиангіогенними засобами у профілактиці раку яєчників, що залежить від нових мереж кровоносних судин.
1. Вступ
Недавні дослідження зосереджувались на протираковій активності флавоноїдів, виділених із рослин (Park et al., 2014; Zhang et al., 2014; Zivkovic et al., 2014). Флавоноїди - це природні поліфеноли, присутні в багатьох різних продуктах харчування, особливо в фруктах та овочах. Попередні дослідження припускали, що флавоноїди мають протипухлинні характеристики і можуть бути в змозі зменшити ризик розвитку раку за допомогою механізмів запобігання окислення та запалення, зменшення ангіогенезу та проліферації клітин та індукції апоптозу (Gates et al., 2009; Kandasamy & Ashokkumar, 2013; Li та ін., 2009; Li, Wang, Guo, Zhao, & Ho, 2014; Ma et al., 2014; Yu et al., 2014). Галангін та міріцетин є членами флавонольного підкласу флавоноїдів з антиоксидантною активністю. Калангін виділяли з кореневища калгану та прополісу. Мірицетин є більш поширеним, ніж галангін, і його можна знайти у фруктах, овочах, горіхах, ягодах, чаї та червоному вині (Basli et al., 2012; Ross & Kasum, 2002).
Ангіогенез - це фізіологічний процес, завдяки якому нові кровоносні судини утворюються із вже існуючих судин (Birbrair et al., 2014). Це також основний крок у переході пухлин, включаючи пухлини яєчників, із доброякісного стану в злоякісний. Ангіогенез, як правило, спокійний у нормальних тканинах дорослої людини (Bertl, Bartsch, & Gerhauser, 2006). Мікротумор, що зростає понад 1 до 2 мм2, стикається з обмеженим харчуванням та надходженням кисню і потребує цілої системи крові, щоб підтримувати власний ріст і викидати метаболіти (Bertl, Bartsch, & Gerhauser, 2006). На відміну від них, дорослі без пухлини не потребують ангіогенезу в звичайних ситуаціях (Fotsis et al., 1993; Glade-Bender, Kandel, & Yamashiro, 2003). Як повідомляється, антиангіогенез є можливим для лікування раку людини і став однією з найбільш перспективних стратегій хіміопрофілактики та лікування раку. Ці крихітні пухлини на ранніх стадіях неможливо успішно діагностувати, але їх подальший розвиток вимагає нової мережі кровоносних судин (Sanchez-Munoz, Perez-Ruiz, Mendiola, Alba, & Gonzalez-Martin, 2009). Попередні дослідження повідомляли, що галангін та мірицетин зменшують ангіогенез в ендотеліальних клітинах пуповинної вени людини (HUVEC) (Kim, Liu, Guo & Meydani, 2006). Міріцетин також інгібував ангіогенез у моделі безволосих пухлин шкіри миші SKH-1, індукованій УФВ (Jung et al., 2010).
Ендотеліальний фактор росту судин (VEGF) відіграє центральну роль у опосередкуванні розвитку та підтримки судин пухлини (Hefler et al., 2007). Тому терапія проти VEGF є важливою при лікуванні раку. Ген VEGF безпосередньо регулюється індукованим гіпоксією фактором 1α (HIF-1α), гетеродимерним основним білком спіралі-спіралі (Forsythe et al., 1996). Стабілізація та підвищення регуляції HIF-1α сприяє експресії VEGF шляхом зв'язування з HIF-реагуючими елементами (HRE) у промоторах. Рибосомна білкова S6-кіназа (p70S6K), серин/треонінкіназа, яка діє нижче за течією шляху PI3K/Akt, контролює ангіогенез, регулюючи білки HIF-1α та VEGF (Bian, Shi, Meng, Jiang, Liu, & Jiang, 2010). Akt є посередником VEGF, який підсилює патологічний ангіогенез і ріст пухлини, пов'язаний з аномаліями матриксу в шкірі та судинах (Chen et al., 2005; Somanath, Razorenova, Chen, & Byzova, 2006). P21, відомий як регулятор прогресування клітинного циклу, також негативно регулює білок VEGF в деяких ракових клітинах, включаючи клітини OVCAR-3 (Farhang, Goossens, & Haigh, 2013; Luo, Rankin, Juliano, Jiang, & Chen, 2012).
У цьому дослідженні ефекти галангіну та мірицетину на зменшення ангіогенезу вивчались у двох стійких до платини клітинних лініях раку яєчників: A2780/CP70 та OVCAR-3. Були також досліджені механізми впливу галангіну та мірицетину на ангіогенез.
2. Матеріали та методи
2.1. Культура клітин та реагенти
2.2. Розмноження клітин
Інгібування росту клітин визначали за допомогою набору «CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay» від Promega (Madison, WI, USA). Клітини висівали в 96-лункові планшети при щільності 2 × 10 4/лунку та інкубували при 37 ° С. Клітинам дозволяли прикріпитися до дна протягом ночі, а потім обробляли різними концентраціями калангіну/мірицетину. Контрольні клітини отримували рівний об'єм лише DMSO. Через 24 години до кожної лунки додавали 100 мкл розведеного розчину реагенту CellTiter 96 AQueous One Solution (80 мкл PBS + 20 мкл реагенту CellTiter 96 AQueous One Solution). Потім клітини інкубували при температурі 37 ° С ще 1 год і вимірювали при 490 нм. Життєздатність клітин виражали у відсотках від контролю у трьох незалежних експериментах.
2.3. ІФА для VEGF
Рівні VEGF у супернатантах клітинних культур аналізували за допомогою імуноаналітичного набору Quantikine Human VEGF (R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота, США). Клітини A2780/CP70 та OVCAR-3 (2 × 10 4/лунка) висівали в 96-лункові планшети та інкубували протягом ночі. Згодом клітини обробляли калангіном/мірицетином або ДМСО протягом 24 годин у вільному від сироватки середовищі. Були зібрані супернатанти культури. Кількості VEGF вимірювали відповідно до вказівок виробника, нормалізували до загального рівня білка і виражали у відсотках від необробленого контролю.