Дієтичний білок тріски відновлює інсулінову активацію фосфатидилінозитол 3-кіназиАкт та

Анотація

Розвиток периферичної резистентності до інсуліну є важливою особливістю діабету 2 типу (1,2). Скелетні м’язи, на які припадає> 75% утилізації глюкози в постпрандіальному стані (1), є привабливою терапевтичною метою для профілактики цього захворювання. Механізм, за допомогою якого інсулін збільшує поглинання глюкози в м’язах, передбачає транслокацію чутливого до інсуліну транспортера глюкози GLUT4 з внутрішньоклітинного місця зберігання до плазматичної мембрани та Т-канальців (3–5). Показано, що транслокація GLUT4 є дефектною в скелетних м’язах інсулінорезистентних та хворих на цукровий діабет 2 типу (6–8). Інсулін стимулює транслокацію GLUT4, активуючи внутрішню активність його рецептора тирозинкінази щодо внутрішньоклітинних субстратів (5). У скелетних м'язах це призводить до фосфорилювання тирозину субстрату рецептора інсуліну (IRS) -1 та IRS-2, що веде до рекрутингу та активації 3-кінази фосфатидилінозитолу (PI), ключового ферменту в регуляції стимульованого інсуліном транспорту глюкози (9).

білок

Ідентифікація ефекторів PI 3-кінази, що беруть участь у регуляції транспорту глюкози, є предметом інтенсивного дослідження. Сюди входять серин/треонінкінази Akt (також звана протеїнкіназа B [PKB]) та атипова протеїнкіназа C (aPKC). Докази впливу Akt та aPKC на інсулінозалежну регуляцію транспорту глюкози в м’язових клітинах випливають із досліджень трансфекції, що використовують або кіназну неактивну, або надмірну експресію/конститутивно активні форми кіназ (10–13). Тоді як дефект активації інсуліну PI 3-кінази добре встановлений у м’язах резистентних до інсуліну тварин (14–17), потенційна роль будь-якого Akt aPKC у патогенезі інсулінорезистентності залишається недостатньо визначеною. Використовуючи щурів з високим вмістом жиру як модель ожиріння, пов’язаної з інсулінорезистентністю, ми нещодавно виявили, що дія інсуліну як на активність Akt, так і на кіназу aPKC притупляється в скелетних м’язах цих щурів (14). Ці порушення передачі сигналів інсуліну були пов’язані з повним скасуванням інсулін-стимульованої транслокації GLUT4 як до плазматичної мембрани, так і до домів Т-канальців поверхні м’язових клітин (14).

Багато зусиль витрачається на пошук нових терапевтичних підходів для подолання резистентності до інсуліну у людей. Дієтичні втручання виявились корисною та ефективною тактикою сенсибілізації тканин цілі до інсуліну у тварин (18). Наприклад, було показано, що поліненасичені жирні кислоти ω-3, отримані з риби, покращують чутливість до інсуліну у щурів, які харчуються дієтою з високим вмістом жиру (19). Зовсім недавно ми досліджували вплив харчових білків на чутливість до інсуліну при ожирінні, спричиненому дієтою. Ми виявили, що дієтичний білок тріски, але не казеїн або соєвий білок, запобігав розвитку стійкості до інсуліну у всьому тілі, нормалізуючи поглинання глюкози, стимульоване інсуліном, у м’язах щурів, що харчуються жирами. Це спостерігалося, незважаючи на подібний приріст маси тіла, ожиріння та експресію TNF-α як у жировій тканині, так і в скелетних м’язах серед різних дієтичних груп (20).

Тому це дослідження було проведено для з'ясування клітинних механізмів, що викликають сенсибілізуючу дію інсуліну білка тріски у щурів із ожирінням, що харчуються жиром. Більш конкретно, ми перевірили гіпотези, згідно з якими білок тріски запобігає резистентності до інсуліну скелетних м’язів шляхом 1) посилення передачі сигналів інсуліну до PI 3-кінази, Akt та aPKC, 2) збільшення експресії білка GLUT4 та/або 3) поліпшення транслокації GLUT4 до поверхня м’язових клітин.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Матеріали.

Лікування тварин.

Гіперінсулінеміко-еуглікемічний затискач та ін’єкція індикатора.

Гостра стимуляція інсуліном.

Щурам, які голодували протягом ночі, вводили або фізіологічний розчин, або інсулін (8 одиниць/кг) протягом 4 хв, як описано раніше (4). М'язи швидко вирізали і негайно заморозили в рідкому азоті. М'язи гастрокнемія гомогенізували в шести обсягах буфера для лізису (20 ммоль/л Трис, рН 7,5, 140 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л CaCl2, 1 ммоль/л MgCl2, 10% гліцерину, 10 ммоль/л пірофосфату натрію, 10 ммоль/л NaF, 2 ммоль/л Na3VO4, 2 мг/мл бензамідину та 1 ммоль/л PMSF) та коктейль інгібіторів протеази. Окадаєву кислоту (100 нмоль/л) додавали в лізисний буфер для активності кінази Akt та aPKC. М'язові гомогенати розчиняли в 1% NP-40 протягом 1 год при 4 ° C і центрифугували при 14000g протягом 10 хв. Супернатант використовували для досліджень сигналізації про інсулін, як описано нижче.

Фосфорилювання тирозину рецептора інсуліну та IRS.

М’язові лізати (1 мг білка) імунопреципітували 2 мкг антифосфотирозину (4G10), зв’язаного з білком A-сефарозою, протягом ночі при 4 ° C. Імунний комплекс тричі промивали PBS (pH 7,4), що містить 1% NP-40 і 2 ммоль/л Na3VO4, ресуспендували в буфері Леммлі і кип'ятили протягом 5 хв. Білки розчиняли на SDS-PAGE (6% гель) і обробляли для вестерн-блот-аналізу.

Активність ПІ 3-кінази.

М'язовий лізат (1 мг білка) імунопреципітували 2 мкг анти-IRS-1, приєднаного до білка A-сефарози, протягом ночі при 4 ° С. Імунний комплекс промивали двічі промиванням I (PBS, рН 7,4, 1% NP-40 і 2 ммоль/л Na3VO4), двічі промиванням II (100 ммоль/л Трис, рН 7,5, 500 ммоль/л LiCl і 2 ммоль/л Na3VO4) і двічі з промиванням III (10 ммоль/л Tris, рН 7,5, 100 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л EDTA та 2 ммоль/л Na3VO4). Гранули ресуспендували в 70 мкл кіназного буфера (8 ммоль/л Трис, рН 7,5, 80 ммоль/л NaCl, 0,8 ммоль/л ЕДТА, 15 ммоль/л MgCl2, 180 мкмоль/л АТФ і 5 мкКі [γ- 32 P] ATP) та 10 мкл ультразвукової суміші PI (20 мкг l-α-PI, 10 ммоль/л Tris, рН 7,5 та 1 ммоль/л EGTA) протягом 15 хв при 30 ° C. Реакцію зупиняли додаванням 20 мкл 8 моль/л HCl, змішували з 160 мкл CHCl3: CH3OH (1: 1) і центрифугували. Нижні органічні фази були помічені на обробленій оксалатом силікагельній пластині ТШХ і розвинені в CHCl3: CH3OH: H2O: NH4OH (60: 47: 11,6: 2). Пластину висушили та візуалізували за допомогою авторадіографії з посилюючим екраном при -80 ° C.

Діяльність Akt/PKB.

М’язовий лізат (1 мг білка) імунопреципітували 4 мкг анти-Akt 1/2, зв’язаного з білком G-сефарозою, протягом 4 год при 4 ° C. Імунний комплекс промивали двічі промиванням I (PBS, рН 7,4, 1% NP-40 і 100 мкмоль/л Na3VO4) і двічі промиванням II (50 ммоль/л трис, рН 7,5, 10 ммоль/л MgCl2 і 1 ммоль/л DTT). Гранули ресуспендували в 30 мкл кіназного буфера (50 ммоль/л Тріс, рН 7,5, 10 ммоль/л MgCl2, 1 ммоль/л DTT, 8 мкмоль/л АТФ, 2 мкКі [γ- 32 P] АТФ і 50 мкмоль/л Crosstide) протягом 30 хв при 30 ° C. Продукт реакції розчиняли на 40% акриламідному гелі та візуалізували за допомогою авторадіографії з посилюючим екраном при -80 ° C.

Атипова активність ПКС (ζ/λ).

М'язовий лізат (1 мг білка) імунопреципітували 2 мкг анти-РКС (ζ/λ) протягом ночі при 4 ° C, потім імунний комплекс збирали на білку A/G-сефарозі протягом 2 годин. Намистини промивали двічі промиванням I (PBS, рН 7,4, 1% NP-40 і 2 ммоль/л Na3VO4), двічі промиванням II (100 ммоль/л Трис, рН 7,5, 500 ммоль/л LiCl і 100 мкмоль/л Na3VO4) і двічі з промиванням III (50 ммоль/л Трис, рН 7,5, 10 ммоль/л MgCl2 і 100 мкмоль/л Na3VO4). Гранули ресуспендували в 30 мкл кіназного буфера (50 ммоль/л Трис, рН 7,5, 10 ммоль/л MgCl2, 40 мкмоль/л АТФ, 5 мкКі [γ- 32 P] АТФ і 5 мкг основного білка мієліну) протягом 12 хв при 30 ° C. Реакцію зупиняли додаванням буфера Леммлі і нагрівали протягом 30 хв при 37 ° С. Продукт реакції розщеплювали на 13% SDS-PAGE. Гель висушували та візуалізували за допомогою авторадіографії з посилюючим екраном при -80 ° C.