Диференціальна експресія білка знаменує перехід від зараження Opisthorchis viverrini до

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Для листування: [email protected]

Резюме

Вступ

(A) Модель хом'ячка CCA була використана для ідентифікації дисрегульованих білків у хом'яків з індукованою ОВС CCA та у хом'яків, інфікованих Ov ("запалений" стан). Щоб викликати експериментальний ОВС-індукований CCA (група «ОВ-індукований CCA»), хом'яків заражали метацеркаріями Ov і їх дієту доповнювали NDMA. Група «інфікованих Ov» була інфікована Ov, але не отримувала NDMA; () Печінку хом'яка резекували, а iTRAQ та тандемну мас-спектрометрію використовували для визначення рівня експресії білка. Потім антитіла до п'яти білків використовували для підтвердження результатів iTRAQ як у хом'ячка, так і в тканинах людини за допомогою імуноблотингу та імуногістохімії.

Експериментальні процедури

Експериментальне проектування та статистичне обґрунтування

Кількісні експерименти iTRAQ були проведені на цілкових білкових препаратах печінки з трьох груп хом'яків: "Нормальна", "ОВ-індукована CCA" та "Ов-інфікована" групи, використовуючи три біологічні повтори з кожної групи. Для верифікації в тканинах печінки хом'яка вестерн-блот-експерименти та імуногістохімічний аналіз проводили з використанням чотирьох біологічних копій з кожної з трьох експериментальних груп. Вся тканина CCA людини була отримана за інформованою згодою пацієнтів лікарні Срінагарінд, Університет Хон Каен, Таїланд. Для вестерн-блот-експериментів у тканині CCA людини використовували сім біологічних повторностей, і в кожній повторній сусідній непухлинній тканині використовували як контроль. Білки-кандидати були додатково перевірені за допомогою IHC-аналізу на тканині, що містить ТМА, від 68 пацієнтів з CCA, 48 чоловіків та 20 жінок. Метою цього дослідження було виявлення потенційних потенційних клієнтів для подальшого дослідження, і кількість зразків переважно керувалася 1) витратами реагенту; і 2) наявність зразків.

Паразит і тваринна тканина

Метацеркарії яєць отримані від природно заражених риб-ципріноїдів у провінції Хон Каен, Таїланд, за встановленими методами [8]. Коротше кажучи, рибу засвоювали 0,25% пепсин-HCl та метацеркаріями, виділеними з отриманої суспензії. Метацеркарії досліджували мікроскопічно, підраховували і використовували життєздатні кісти для зараження хом'яків (Mesocricetus auratus). Усі зразки тканин тварин були взяті у хом'яків, що використовувались в імуногістохімічному дослідженні ОВС-індукованої CCA, описаному в [8] та затвердженому Комітетом з етики тварин Університету Хон Каен, Таїланд (AEKKU 22/2557). Експериментальна конструкція показана на рис. 1А. Хом'яків утримували в лабораторії досліджень тварин на медичному факультеті Університету Хон Каена за протоколами, затвердженими Комітетом з етики тварин Університету Хон Каен.

Індукована яйцеклітиною CCA у сирійських золотих хом'яків

Дванадцять чоловічих сирійських хом'яків (Mesocricetus auratus) у віці від 4 до 6 тижнів були випадковим чином розділені на три групи по чотири тварини: 1.) група "Звичайна", яка отримувала звичайну мишачу дієту (CP-SWT, Таїланд); 2.) група «ОВ-індукована CCA», яка інфікувалась метацеркаріями 50 Ov шляхом перорального посіву та годувала контрольну дієту з доповненням NDMA протягом перших двох місяців випробування (вводили у воді, доступній у вільному режимі, 12,5 ppm); та 3.) група «інфікованих ОВ», які заразили 50 метацеркаріями Ов пероральним щепленням і годували контрольною дієтою.

Тканина пацієнта

Тканини печінки людини готували, як описано в [14]. Письмова інформована згода була отримана від 68 пацієнтів CCA, 48 чоловіків та 20 жінок, які пройшли резекцію печінки в лікарні Срінагарінд університету Хон Каен, Таїланд між 1999-2010 рр. (HE571283). Пацієнти мали середній вік у роки 57 ± 7,7 (38-74 років). Комітет з етики досліджень людини, Університет Хон Каена, затвердив протоколи дослідження для отримання зразків печінки з біобанку Дослідницького центру печінкової гриппи та холангіокарциноми (HE571294). Заморожену тканину печінки із семи парних випадків пухлини (сусідніх непухлинних та пухлинних) використовували для вестерн-блот, а тканини печінки, вбудовані у парафін, з тих самих випадків використовували для імуногістохімічного аналізу. Тканинні мікрочипи (ТМА) були сконструйовані кафедрою патології медичного факультету Університету Хон Каена, як описано раніше [15]. ТМА містили 68 випадків CCA людини. Для підтвердження присутності інтактної пухлинної тканини підготовлено та оглянуто двома незалежними патологами ділянку блоку ТМА, пофарбовану H&E. Діагностика хворих на CCA оцінювалась за клінічними даними, візуалізаційним аналізом, онкомаркерами та патологією.

Очищення білка від печінки хом'яка

Тканину печінки хом'ячка (100 мг) від кожного хом'ячка в кожній групі суспендували в 600 мкл буфера для лізису (7М сечовини, 2М тіосечовини, 4% (мас./Об.) CHAPS і 40 мМ трис-основи) та гомогенізували за допомогою гомогенізатора мікротрубок при 4 ° C протягом 5 хв. Зразок обробляли ультразвуком протягом 1 хв і інкубували на льоду протягом 30 хв. Солюбілізовані зразки центрифугували при 12000 × g протягом 20 хв при 4 ° C. Зразки білка осаджували 6 обсягами холодного ацетону при -20 ° С протягом ночі. Потім білки гранулювали, використовуючи центрифугування при 8000 × g при 4 ° C протягом 10 хв, і гранули ресуспендували в 0,5М бікарбонаті триетиламонію (TEAB), рН 8,5 (Sigma-Aldrich) і 0,1% SDS. Кількості білків визначали за допомогою аналізу білків Бредфорда (Bio-Rad), використовуючи рекомендації виробників.

Відновлення, алкілування та маркування iTRAQ

Загальний білок печінки з трьох біологічних повторностей аналізували в трьох експериментах iTRAQ. Білки печінки (100 мкг) від трьох хом'яків у кожній групі редукували, алкілювали та мітили за допомогою мультиплексного набору iTRAQ 8PLEX (AB Sciex, США). Коротко, зразки білка зменшували за допомогою 10 мМ дитиотрейтолу при 60 ° С протягом 1 год і алкилировали в 50 мМ йодоацетаміду або метилметантиосульфонаті (ММТС) при 37 ° С протягом 30 хв. Потім білки перетравлювали 2 мкг трипсину при 37 ° С протягом 16 годин. Реагенти для мічення iTRAQ готували шляхом додавання 50 мкл ізопропанолу до кожного флакона, а потім їх використовували для маркування зразків пептидів протягом 2 годин при кімнатній температурі. Мічені пептиди об'єднували у три суміші, що представляли три біологічні повторності, кожна з яких містила чотири зразки пептидів ("ОВ-індукований CCA", "Ов-інфікований" та два контрольні канали). Після маркування пептидні суміші очищали за допомогою іонообмінних колон HiTrap (GE Healthcare) та знесолювали за допомогою картриджа Sep-Pak Vac C18 (Waters, США). Потім очищені фракції ліофілізували перед OFFGEL ™ .