Для блокування поглинання гексоз потрібно одночасне вибивання щонайменше 20 генів-транспортерів

Institut für Mikrobiologie, Heinrich-Heine-Universität, Universitätsstr. 1, Геб. 26.12.01, D-40225 Дюссельдорф, Німеччина

Анотація

Сімейство транспортерів гексози Saccharomyces cerevisiae містить 18 білків (Hxt1–17, Gal2). Тут ми демонструємо, що всі ці білки, крім Hxt12, і додатково три члени сімейства транспортерів мальтози (Agt1, Ydl247, Yjr160) здатні транспортувати гексози. У дріжджовому штамі видалено HXT1–17, GAL2, AGT1, YDL247w і YJR160c, споживання глюкози та транспортна діяльність були повністю скасовані. Однак у якості додаткової делеції гена сенсора глюкози ВЯП3 частково відновлений ріст гексоз, наші дані вказують на існування ще більшої кількості білків, здатних транспортувати гексози в дріжджах.

1. Вступ

Переважними джерелами вуглецю для більшості прокаріотичних та еукаріотичних клітин є вуглеводи, перш за все моносахаридна глюкоза. Ця біомолекула становить більшу частину органічної речовини на землі. Обов'язковим і важливим етапом утилізації глюкози є її транспорт через плазматичну мембрану в клітини, процес, який досягається транспортерними білками. У різних організмах еволюціонували різні механізми, що опосередковують транспорт глюкози, тобто протонні системи симпорту, котранспортери Na + -глюкози, системи, що зв'язують білок, системи фосфотрансферази та полегшені дифузійні системи [1-3]. Одними з найбільш відомих організмів, що використовують глюкозу, є дріжджі Saccharomyces cerevisiae. Сімейство пермеаз дріжджових цукрів складається з 34 білків, 18 з яких - підродина транспортера гексози [4-6] (рис. 1). Оскільки транспорт через плазматичну мембрану є важливим кроком у контролі швидкості метаболізму глюкози, з'ясування функцій цієї безлічі білків, пов'язаних з транспортером глюкози, є принципово важливим питанням. Більше того, це може надати розуміння загальних принципів транспорту глюкози в інших організмах.

2 Матеріали та методи

2.1 Штами дріжджів та умови росту

Штами дріжджів були такими, як описано в таблиці 1. Середовище та умови росту були такими, як описано в [7]. Властивості росту визначали на синтетичному середовищі (YNB + (NH4) 2SO4 + джерело вуглецю), доповненому лише для ауксотрофних потреб.

Процідити	Генотип	Джерело
CEN.PK2‐1C (= VW1A)	MATα leu2‐3,112 ura3‐52 trp1‐289 his3 ‐ Δ1 MAL2‐8 c SUC2 hxt17Δ	К.‐Д. Ентіан
EBY.VW367 +	CEN.PK2‐1C hxt13Δ: loxP hxt15Δ: loxP hxt16Δ: loxP hxt14Δ: loxP hxt12Δ: loxP hxt9Δ: loxP hxt11Δ: loxP hxt10Δ: loxP hxt8Δ: loxP hxt514Δ: loxP hxt2Δ: loxP	Це дослідження
EBY.VW1000	EBY.VW367 + hxt367Δ: loxP gal2Δ	Це дослідження
EBY.VW2000	EBY.VW1000 snf3Δ: loxP	Це дослідження
EBY.VW4000	EBY.VW1000 stl1Δ: loxP agt1Δ: loxP ydl247wΔ: loxP yjr160cΔ: loxP	Це дослідження
EBY.VW5000	EBY.VW4000 snf3Δ: loxP rgt2Δ: loxP	Це дослідження
EBY.FY100B	MATα ura3‐52 trp1Δ63 his3Δ200 (отримано з FY1679)	Це дослідження
EBY.FY367 +	EBY.FY100B hxt13Δ: loxP hxt15Δ: loxP hxt16Δ: loxP hxt17Δ: loxP hxt14Δ: loxP hxt12Δ: loxP hxt9Δ: loxP hxt11Δ: loxP hxt10Δ: loxP hxt8Δ: loxP hxt514Δ: loxP hxt2Δ: loxP	Це дослідження

2.2 Побудова мутантів множинної делеції

Δhxt13/Δhxt17	5′‐ CGCACCACCCGTGGAAAAAGAGTGGTCAGATGGATTTGATGACAA CAGCTGAAGCTTCGTACGC ‐3 ′
5′‐ TTGAGAACTTCAAAAATTTCTTCCAATCCTTCTTCTCGGTCTTAC GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δhxt15/Δhxt16	5′‐ ATGGCAAGCGAACAGTCCTCACCAGAAATTAATGCAGATAATCTAA CAGCTGAAGCTTCGTACGC ‐3 ′
5′‐ AGCATGTTTATCAAGCGCGCATATTGATCAATTAAAACTCTTTGGGAA GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δhxt14	5′‐ GGCAGGGGAAGGGATTATAATGTAACCATTAAGTATCTAGATGAT CAGCTGAAGCTTCGTACGC ‐3 ′
5′‐ TCCTAGTTTGAAATCAATTTTGGATACAATCATTGGTGTTAAAAG GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δhxt12	5′‐ ATCTTTGGTTGGGATACCGGTACCATTTCTGGTTTTGTTAACCTTTC CAGCTGAAGCTTCGTACGC ‐3 ′
5′‐ GGACAAAGAAAAAGACATAAAAGTATGCAAAAACCAGACAGCCTAAGA GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δhxt11	5′‐ ATGTCAGGTGTTAATAATACATCCGCAAATGAGTTATCTACTACCATG TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ GGACAAAGAAAAAGACATAAAAGTATGCAAAAACCAGACAGCCTAAGA GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δhxt10	5′‐ ATGGTTAGTTCAAGTGTTTCCATTTTGGGGACTAGCGCCAAGGCATCC TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ AATTATTTACTATCAACAATAACTAATGGTGTACTGCTTGTTGGTTGTGG GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δhxt9	5′‐ GTAGCAAATGCACCATCTGTAAAAACTGAGCATAATGACTCTAAAAAC TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ GGACAAAGAAAAAGACATAAAAGTATGCAAAAACCAGACAGCCTAAGA GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δhxt8	5′‐ ATGACTGATCGTAAAACCAACTTGCCAGAAGAACCGATTTTCGAAGAG TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ GGTCTAAAACATTCTTTTGTAGAAGGGTTTCTCGTCATGCTGTAATTT GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δhxt5 ‐ hxt1 ‐ hxt4	5′‐ ATGTCGGAACTTGAAAACGCTCATCAAGGCCCCTTGGAAGGGTCTGCTACT TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ TTAGATCATCAGCGTTGTAGTCAGTACCTCTCTTGTTTGGTGGAACCAAG GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δhxt2	5′‐ ATGTCTGAATTCGCTACTAGCCGCGTTGAAAGTGGCTCTCAACAAACT TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ TATTCCTCGGAAACTCTTTTTTCTTTTGAGATCCAGCTACCAGAT GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δhxt3 ‐ hxt6 ‐ hxt7	5′‐ ATGAATTCAACTCCAGATTTAATATCTCCACAAAAGTCAAGTGAGAATTCG TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ AAGTTTCTTTGTCTCCGTCCCACTCAACTTTCTGAGAACAAATGATC GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δstl1	5′‐ ATGAAGGATTTAAAATTATCGAATTTCAAAGGCAAATTTATAAGCAGA TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ ACCCTCAAAATTTGCTTTATCGTTCACTGTATCTTCATTTTTGATGTT GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δagt1/Δagt1: lacZ	5′‐ ATGAAAAATATCATTTCATTGGTAAGCAAGAAGAAGGCTGCCTCAAAA TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ TAATTCTCGCTGTTTTATGCTTGAGGACTGACTGATACTCTCTCATCAGC GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δydl247w/Δyjr160c	5′‐ ATGAAAAACTTATCTTTTCTCATAAACAGAAGAAAGGAAAATACAAGT TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ TTCCTCTGCAATGGAAGCTTCGATATCTCCCTTGGGGTCGTTATG GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δsnf3	5′‐ ATGGATCCTAATAGTAACAGTTCTAGCGAAACATTACGCCAAGAGAAA TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ TATTTCAAATCATTATTTTCATTTACAGGTTGATTAGTGGCGTTTTC GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Δrgt2	5′‐ ATGAACGATAGCCAAAACTGCCTACGACAGAGGGAAGAAAATAGTCAT TTCGTACGCTGCAGGTCGAC ‐3 ′
5′‐ GGGGGAAGTGTATTGGCTGTGCTTACTAGCGAGGTCACTCGTCCAATT GCATAGGCCACTAGTGGATCTG ‐3 ′
Гомологія до генів транспортера цукру, напівжирний; гомологія до kanMX касета, курсив.