Екстракт рослинних ліків активує АМФ-активовану білкову кіназу у щурів із ожирінням, що викликаються дієтою
1 Лабораторія клінічної біології та фармакогеноміки та Центр клінічних досліджень та геноміки, Інститут східної медицини, Університет Кюн Хі, 26 Kyungheedae-ro, Dongdaemun-gu, Сеул 130-701, Республіка Корея
2 Департамент превентивної медицини, Коледж східної медицини, Університет Кюн Хі, 26 Kyungheedae-ro, Dongdaemun-gu, Сеул 130-701, Республіка Корея
Анотація
1. Вступ
Ожиріння через нерівновагу споживання та витрати енергії досягло масштабів епідемії в деяких частинах світу. Окрім вищої маси жиру та маси тіла [1], ожиріння пов'язане з вищим ризиком таких проблем зі здоров'ям, як серцево-судинні захворювання, інсулінорезистентність та цукровий діабет, гіперліпідемія, артроз, багато форм раку та психологічний стрес [2, 3].
OB-1 складається з Сперма Benincasae, Laminaria japonica Арешон., Піні Фоліум, Молі Фоліум, Цитрус аврантій Лінн., І Трава ефедри (Materia medica, ISBN: 8985897373). Сперма Benincasae є сечогінним засобом, який застосовувався для виведення токсинів та набряків з організму з ранніх часів. Laminaria japonica Areschon повідомлялося, що він має ефект проти ожиріння [4]. Відомо, що Піні Фоліум збільшує обмін ліпідів у сироватці крові та Молі Фоліум пригнічує ожиріння. Також повідомлялося, що Citrus aurantium Linn збільшує базальний рівень метаболізму, діє як діуретик та зменшує активність ліпази [5]. Трава ефедри - добре відомий препарат проти ожиріння, що зменшує вагу тіла [6].
Індуковані ожирінням зміни тканини адипоцитів призводять до зміни експресії або функції таких важливих ендокринних гормонів, як лептин і адипонектин. Рівень лептину натощак надзвичайно підвищений в адипоцитах у людей із ожирінням, і експресія його генів значно підвищується у щурів з ожирінням, спричиненим дієтою [1, 7]. На відміну від лептину, адипонектин відновлюється в тканині адипоцитів у людей із ожирінням [8].
AMPK відомий як ключова молекула, яка регулює енергетичний баланс, масу тіла, споживання їжі та метаболічний баланс ліпідів та глюкози. Активація AMPK переключає клітини з споживання АТФ на активні процеси продукування АТФ, такі як окислення жирних кислот та глюкози. З цих причин AMPK став предметом багатьох останніх досліджень як терапевтична мішень метаболічних захворювань [9–11].
2. Методи та матеріали
2.1. Підготовка OB-1
Шість трав, Насіння Benincasae, Laminaria japonica Areschon, Pini Folium, Moli Folium, Citrus aurantium Linn, і Трава ефедри, були придбані в Omniherb (Кьонг Бук, Корея) і занурені в 1 л 80% етанолу, а потім оброблені ультразвуком протягом 30 хв. Отриманий екстракт фільтрували через скляний фільтр за допомогою вакуумного насоса. Ротаційний вакуумний випарник (Eyela, Японія) був використаний для концентрування рідкого екстракту при 45 ° C. Потім концентрований екстракт ліофілізували і відновлювали у фізіологічному розчині при робочій концентрації. OB-1 готується з цих шести екстрактів трав у співвідношенні 1: 1: 1: 1: 1: 1.
2.2. Експериментальний дизайн
Чотири тижні самців щурів Wistar вагою 140-160 г були придбані у Central Laboratory Animal, Inc. (Сеул, Республіка Корея). Тварин обстежували згідно з Керівництвом для експериментів на тваринах під редакцією Корейської академії медичних наук. По чотири щури утримувались у клітці під час 12: 12-годинного циклу світло-темрява, вологості 50% та
° С Поживні компоненти та співвідношення складу контрольної та високожирної дієти вказані в таблиці 1 [1, 12]. Щурів годували стандартною лабораторною чау-чау (Purina Co .; Республіка Корея) і протягом 7 днів акліматизували до навколишнього середовища перед початком експерименту. Після акліматизації контрольна група (
) отримували стандартну лабораторну дієту чау (контрольна дієта) та групу з високим вмістом жиру (
) отримували дієту, описану в таблиці 1. Поживний компонент контрольної дієти (3,665 ккал/г) становив 65% вуглеводів, 20% білків і 4,5% ліпідів. Дієта з високим вмістом жиру (4,058 ккал/г) являла собою суміш, що містить дуже смачну людську їжу (печиво, сир, ковбаса, чіпси, шоколад та мигдаль) у пропорції 2: 2: 2: 2: 1: 1 та рівна кількість (у грамах) контрольної лабораторної дієти чау. Ця дієта з високим вмістом жиру містила 32%, 12% та 31% енергії у вигляді вуглеводів, білків та жирів відповідно. Тварин зважували на початку експерименту та щотижня після цього. Після 5 тижнів годування щурів як контрольної, так і дієти з високим вмістом жиру, кожна група була випадковим чином розділена на групи, оброблені фізіологічним розчином або групи OB-1. Щурів годували зазначеною дієтою, обробляючи фізіологічним розчином або 40 мг/100 г OB-1 щодня протягом 5 тижнів. Щурів забивали анестезією через 10 тижнів після початку дієтичного лікування.
2.3. Зразки органів
Зразки жирової тканини епідидиму та печінки енуклеювали від щурів і промивали в холодному сольовому розчині. Зразки адипоцитів епідидиму негайно зберігали в морозильній камері -70 ° C для подальшого виділення мРНК. Зразки печінки фіксували на ніч у 10% нейтральному буферному формаліні (NBF) для підготовки до гістологічного фарбування. Потім фіксовані зразки печінки замочували у 30% сахарозі (Sigma; Сент-Луїс, Міссурі, США), поки зразки печінки не опускалися на дно пляшки. Після видалення надлишкової рідини із зразків їх зберігали при -70 ° C.
2.4. Аналіз RT-PCR
2.5. Імуноблот-аналіз
Тканини гомогенізували в буфері, що містив 50 мМ трис-HCl, рН 7,4, 5 мМ EDTA, 150 мМ NaCl, 0,1% додецилсульфату натрію (SDS), 1% Triton X-100 та коктейль інгібітора протеази (104 мМ AEBSF, 0,08 мМ Апротинін, 2 мМ лейпептину, 4 мМ бестатину, 1,5 мМ пепстатину А та 1,4 мМ Е-64) на льоду. Гомогенізовану тканину інкубували протягом 30 хв на льоду з наступним центрифугуванням при 14000 об/хв протягом 30 хв при 4 ° С. Супернатант використовували для проведення аналізу Бредфорда (Bio-rad) для визначення концентрації білка. Потім 50 μг загального білка відокремлювали на 10% відновлювальних поліакриламідних гелях і переносили в мембрани. Імуноблот-аналіз проводили з використанням антитіл до фосфо-AMPK (Cell Signaling Technology; Beverly, MA, USA) або α-антитіла до тубуліну та імунореактивні білки були виявлені за допомогою хемілюмінесценції.
2.6. Виділення жирових клітин з адипоцитів
Жирові клітини виділяли обробкою колагеназою відповідно до методу, описаного раніше [13]. Коротко, зразки жирової тканини епідидиму подрібнювали при кімнатній температурі та інкубували з 1,5 г/л колагенази в 10 мл бікарбонату Кребса-Рінгера (KRB; 10 нМ HEPES, 6 мМ глюкози та 30 г/л бичачого сироваткового альбуміну, рН 7,4, попередньо загазований 95% O2/5% CO2) протягом 30 хв при 37 ° C на водяній бані, що струшується. Потім адипоцити візуалізували за допомогою мікроскопії та фотографували.
2.7. Морфологія печінки
Описані вище фіксовані зразки печінки вбудовували в сполуку оптичної температури різання (OCT) і 10 μМ крізів вирізали на кріостаті. Зрізи тканин фарбували олійно-червоним O (Sigma) для візуалізації нейтральних ліпідів, а ядра контрастували гематоксиліном (Gill №2; Sigma). Oil Red O розчинили в 99% -ному ізопропанолі, залишили на ніч при кімнатній температурі та відфільтрували за допомогою фільтрувального паперу Whatman No. 2 (ватман; Великобританія). Цей маточний розчин змішували з дистильованою водою (2: 3) і повторно фільтрували за допомогою фільтрувального паперу Whatman No. 2 перед використанням. Скла, що містять розсічену тканину печінки, промивали ізопропанолом протягом 10 хв і фарбували робочим розчином Oil Red O протягом 15 хв. Потім предметне скло знебарвлювали 70% ізопропанолом протягом 3 хв, промивали дистильованою водою протягом 5 хв і фарбували гематоксиліном протягом 30 сек. Забарвлені предметні стекла проводили остаточне промивання дистильованою водою, сушили на повітрі і монтували гліцериновим желе.