Ендогенно окислена мітохондріальна ДНК індукує запальні реакції in vivo та in vitro -

Департамент ревматології та досліджень запалення, Університет міста Гетеборг, Швеція; і

1 Листування: Департамент ревматології та досліджень запалення, Університет міста Гетеборг, Guldhedsgatan 10A, 41346 Гетеборг, Швеція. Електронна пошта: [email protected]

Департамент ревматології та досліджень запалення, Університет міста Гетеборг, Швеція; і

Кафедра клінічної хімії, Університетська лікарня Салгренська, Гетеборг, Швеція

Департамент ревматології та досліджень запалення, Університет міста Гетеборг, Швеція; і

1 Листування: Кафедра ревматології та досліджень запалення, Університет міста Гетеборг, Guldhedsgatan 10A, 41346 Göteborg, Швеція. Електронна пошта: [email protected]

Департамент ревматології та досліджень запалення, Університет міста Гетеборг, Швеція; і

Кафедра клінічної хімії, Університетська лікарня Салгренська, Гетеборг, Швеція

Кафедра ревматології та досліджень запалення, Університет міста Гетеборг, Швеція; і

Департамент ревматології та досліджень запалення, Університет міста Гетеборг, Швеція; і

Анотація

Ми повідомляємо, що мітохондріальна ДНК (mtDNA) є запальною хворобою in vitro та in vivo в результаті присутності неметильованих послідовностей CpG та її окисного статусу. Очищені людські та мишачі мтДНК індукували артрит при внутрішньосуглобовому введенні мишам. Важливо, що олігодезоксинуклеотид, який містив одну окисно пошкоджену основу, також викликав артрит при введенні внутрішньовенно. у мишей. На відміну від цього, ні людська, ні мишача ДНК не викликали запалення. Індукований мтДНК артрит не залежав ні від В-клітин, ні від Т-клітин, але опосередковувався моноцитами/макрофагами. Індукований mtDNA ядерний фактор κκB призвів до утворення фактора некрозу пухлини α, потужного артритогенного фактора. Нарешті, позаклітинна мтДНК була виявлена в синовіальних рідинах хворих на ревматоїдний артрит, але не у контрольних суб’єктів. Ми прийшли до висновку, що ендогенна мтДНК виявляє запальні властивості внаслідок вмісту неметильованих мотивів CpG та окисно пошкоджених аддуктів.

ВСТУП

Оскільки мтДНК є мішенню пошкодження вільними радикалами внаслідок своєї близькості до ланцюгових реакцій переносу електронів і оскільки опосередковані вільними радикалами пошкодження мтДНК відновлюються з низькою ефективністю, ми досліджували внесок окисно пошкодженої ДНК в артритогенність. Дійсно, олігонуклеотид, у якого відсутні мотиви CpG, але який містив єдиний 8-гідрокси-2'-дезоксигуанозин (8-оксидG), був запальним у природних умовах in vivo. На противагу цьому, олігодезоксинуклеотид (ODN) з точно такою ж послідовністю, за винятком того, що в ньому не було окисленого залишку, був повністю інертним in vivo.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Підготовка зразка ДНК

мтДНК екстрагували з мітохондрій ізольованих м'язів людини та з мишачих (штаму NMRI) м'язів та мітохондрій печінки, по суті, як описано раніше [6]. нДНК екстрагували з ядер, виділених з печінки мишей ЯМР, по суті, як описано [7]. Фрагменти ампліфікованої полімеразною ланцюговою реакцією (ПЛР) ПЛР-I та ПЛР-II людської мтДНК отримували за допомогою праймерів 5'-TAGAAACCGTCTGAACTATC-3 '(вперед) та 5'-CCACAGATTTCAGAGCATT-3' (реверс) для ПЛР-I та 5′ ‐ CACATTACAGTCAAATCCCT ‐ 3 ′ (вперед) та 5′ ‐ TTGTATTGATGAGATTAGTA ‐ 3 ′ (реверс) для ПЛР-II. Ампліфіковані фрагменти ДНК відповідають послідовностям від нуклеотиду (nt) 7171 до nt 7611 (PCR ‐ I; 421 bp) та nt 15761 до nt 16487 (PCR ‐ II; 727 bp) в геномі мітохондрій людини (номер приєднання GenBank X93334; [8]). Продукти ПЛР очищали за допомогою набору для очищення ПЛР (Boehringer Mannheim, Мангейм, Німеччина) і відновлювали у забуференному фосфатом сольовому розчині (PBS) перед внутрішньосуглобовим (i.a.) введенням (5 мкг на колінний суглоб) мишам ЯМРТ. GpC – ODN, 5′-TCCATGAGCTTCCTGATGCT ‐ 3 ′ та oxoGpC – ODN, 5′ ‐ TCCATGAXCTTCCTGATGCT ‐ 3 ′, де X = 8 ‐ oxodG, були синтезовані за допомогою SGSDNA (Стокгольм, Швеція).

Ін’єкції ДНК у мишей

Зразки мтДНК, нДНК та ODN (20 мкл об., що містить 5 мкг ДНК або 10 нмоль ODN) вводили i.a. в колінах у самок мишей віком від 6 до 8 тижнів [миші BALB/c з ALAB, Стокгольм, Швеція; CB17 та миші з важким комбінованим імунодефіцитом (SCID) від M&B, Bomholtvej, Данія; NMRI миші від B&K, Universal AB, Соллентуна, Швеція]. Всі тварини були розміщені в приміщенні для тварин відділення ревматології та досліджень запалення в Університеті Гетеборг (Швеція) у стандартних умовах. Ін'єкційних мишей вбивали через 3 або 14 днів, а суглоби видаляли для гістопатології та імуногістохімії.

Виснаження імунних клітин in vivo

У самок мишей ЯМР виснажили моноцити периферичної крові шляхом лікування етопозидом (Bristol Myers Squibb AB, Bromma, Швеція), який вводили підшкірно (sc) у дозі 12,5 мг/кг щодня, починаючи за 2 дні до ін'єкції ДНК, і продовжували протягом курсу експерименту (3 дні). Це лікування вибірково виснажує моноцити, як було продемонстровано раніше [9]. Контрольні миші отримували s.c. ін’єкції PBS. Самки мишей BALB/c (віком 6–8 тижнів) виснажували гранулоцити шляхом внутрішньочеревної (i.p.) попередньої обробки 1 мг моноклонального антитіла (mAb) RB6‐8C5 [10] за 2 год до внутрішньоутробного введення. ін'єкції мтДНК. Контрольним мишам попередньо обробляли mAb щурячого анти-овальбуміну (анти-OVA) імуноглобуліну G (IgG).

Гістопатологія та імуногістохімія суглобів мишей

Гістопатологічне та імуногістохімічне дослідження суглобів мишей проводили, як описано раніше [4]. Тяжкість артриту на ділянках колінного суглоба оцінювали сліпим спостерігачем і оцінювали за шкалою 0–3, де 0 = відсутні ознаки запалення, 1 = легке запалення, що характеризується гіперплазією синовіального шару оболонки, і 2–3 = підвищення рівня запалення, що характеризується припливом запальних клітин у синовіальну тканину. Для довідкових цілей, суглоб, показаний на рис. 1а, оцінюється як бал 2, а показник на малюнку 1б оцінюється як 0.

Антисмисловий ODN до ядерного фактора (NF) ‐κB

Експресія субодиниці p65 NF κB була заблокована у самок мишей NMRI i.p. введення 900 мкг антисмислового ODN, 5'-GAAACAGATCGTCCATGGT-3 ', або невідповідного контрольного ODN, 5'-GAAACAGATCGTCTATGGT-3', за 2 дні до i.a. ін'єкція мтДНК. Ці модифіковані фосфоротіоатом ODN були синтезовані CyberGene AB (Huddinge, Швеція). У гістопатологічних зрізах суглобів мишей, яким вводили внутрішньовенно, не спостерігали артриту. з антисмисловим або невідповідним ОДН у дозі 900 мкг на мишу.

Вимірювання фактора проліферації та фактора некрозу пухлини α (TNF ‐ α)

Наївні клітини мишачої селезінки від чотирьох окремих мишей ЯМР інкубували у концентрації 2 × 10 6 клітин/мл у середовищі Іскове, що містить 10% фетальної телячої сироватки. Клітини культивували при 37 ° С у 5% СО2 у присутності 10 мкг/мл мтДНК, 10 мкг/мл нДНК або лише середовища протягом 24 год (аналіз TNF-α) або протягом 68 год (аналіз проліферації). 24-годинні супернатанти культури аналізували на вироблення TNF-α за допомогою імуноферментного аналізу (ELISA; R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота). Для вивчення реакцій на проліферацію 68-годинні культури імпульсували 3 H-тимідином протягом 4 годин, клітини збирали на фільтри та вимірювали включення 3 H-тимідину в β-лічильник.