Езетиміб та симвастатин знижують рівень холестерину у личинок даніо, що харчуються дієтою з високим вмістом холестерину
1 Медичний факультет Каліфорнійського університету, Сан-Дієго, Ла-Холла, Каліфорнія 92093, США
Анотація
1. Вступ
У 2009 р. Ми вперше запропонували використовувати даніо як модельний організм для вивчення конкретних судинних подій, що мають значення для розвитку атеросклерозу людини [1]. Годування дорослих даніо-риб дієтою з високим вмістом холестерину (ГХЦ) призводить до гіперхолестеринемії, загальний рівень холестерину в плазмі крові досягає 800 мг/дл, глибоке окислення ліпопротеїнів та утворення судинних уражень, що нагадують жирові прожилки людини. Чо і його колеги використовували дорослих даніо, які годували HCD, для вивчення впливу харчових добавок та підсолоджувачів на рівень холестерину в плазмі крові та активність CETP [2–4]. Оптична прозорість личинок даніо протягом перших 30 днів після запліднення (dpf) дає можливість мікроскопічного спостереження за накопиченням ліпідів у судинах, рекрутуванням мієлоїдних клітин, утворенням клітин піни макрофагів, дезорганізацією шару ендотеліальних клітин та збільшенням активності судинного PLA2 та проникність судин - все це викликано коротким (5–14 днів) харчуванням HCD [1, 5]. Крім того, наш нещодавній звіт демонструє застосування трансгенних hsp70: IK17-EGFP даніо, з умовною експресією кон'югованого EGFP антитіла IK17, специфічного до окисленого ЛПНЩ, при вивченні в природних умовах окиснення ліпопротеїнів та при випробуванні терапевтичних ефектів антиоксидантів [5].
Оскільки годування данина даними HCD веде до значного окиснення ліпопротеїнів, ми далі охарактеризували окислене ліпідне середовище у личинок, що харчуються HCD [6]. Двотижневе годування HCD призвело до 70-кратного збільшення рівня окислених ефірів холестерину, окислених фосфоліпідів та лізофосфоліпідів у гомогенатах даніо. Примітно, що специфічні окислені молекули ліпідів, виявлені у личинках даніо, що харчуються HCD, за допомогою рідинної хроматографії та мас-спектрометрії були ідентичними таким, що виявлені при атеросклеротичних ураженнях людини та миші [6]. Ліпопротеїни, виділені з личинок, що харчуються HCD, активують мишачі макрофаги в пробірці, із зразком фосфорилювання ERK1/2, JNK та Akt та розповсюдження клітин, подібним до того, що індукується мінімально окисленим LDL людини [6].
Таким чином, наша робота та робота інших свідчать про те, що гіперхолестеринемія та окислення ліпопротеїнів, досягнуті у даніо, та характеристики судинного накопичення ліпідів та запальних процесів, що стосуються атерогенезу людини, роблять модель даніо привабливою в природних умовах система для випробування нових терапевтичних підходів та вивчення механізмів існуючих препаратів. Метою цього дослідження було дослідити, чи можуть симвастатин та езетиміб, основні препарати, що застосовуються для лікування гіперхолестеринемії у людей, також знижувати рівень холестерину у личинок даніо, що харчуються HCD.
2. Матеріали та методи
2.1. Утримання та годівля даніо
Ембріони даніо дикого типу (AB) отримані в пробірці запліднення та природний нерест дорослих, що підтримується при температурі 28 ° C на 14/10 годинному циклі світло/темрява та проводиться, як описано [7]. Личинок даніо годували двічі на день, починаючи з 5-го дня після запліднення (dpf), або контрольною дієтою (Золоті перлини, розміром 100-200 мм від Brine Shrimp Direct), або HCD (4% холестерину, розчиненого в діетиловому ефірі, доданому до золотистого Перли) протягом 14 днів, як описано в нашій попередній роботі [1]. Всі дослідження на тваринах були схвалені Комітетом з догляду за тваринами та використання з Каліфорнійського університету, Сан-Дієго.
2.2. Лікування езетимібом та симвастатином
2.3. Екстракція ліпідів з гомогенатів даніо та вимірювання холестерину
Наприкінці періоду годівлі/лікування 20 личинок даніо в кожній експериментальній групі були евтаназовані під впливом 0,05% трикаїну (Sigma). Живіт, що містив неперетравлену їжу, видаляли, а решта тіла об'єднували та обережно гомогенізували в 200 μL крижаного PBS в трубці епендорфа за допомогою пластикового товкача. Після обертання залишків тканин супернатант, що представляє рідини тіла, використовували для подальшого аналізу. Вміст білка в гомогенатах визначали за допомогою аналізу Бредфорда з набором BCA Protein Assay Kit (Pierce). Загальний ліпід екстрагували з гомогенатів даніо, як ми вже описали раніше [6]. Коротше кажучи, гомогенати тканин доповнювали 50 μг стигмастеролу, внутрішнього стандарту для контролю відновлення вилучених стеринів. Повну екстракцію ліпідів проводили з використанням метанолу/дихлорметану 1: 2. Ефіри холестерину омилювали, а загальний вільний холестерин і стигмастерол вимірювали за допомогою газового хроматографа Shimadzu GC-2014 за допомогою
(i.d.) ZB-5HT інфернальна капілярна колонка, товщина плівки 0,2 μм (Phenomenex). Норми холестерину та стигмастеролу аналізували паралельно з експериментальними зразками.
2.4. Статистика
-тест був використаний для аналізу відмінностей між засобами 2 груп.
було використано як поріг значущості.
3. Результати та обговорення
Раніше ми повідомляли, що рівень холестерину в плазмі у дорослих даніо піднімається з 200 до 800 мг/дл після 12 тижнів годування HCD. Личинки даніо занадто малі, щоб забирати кров. Таким чином, ми вимірювали рівень холестерину в рідинах, виділених з личинок, з яких видаляли черевні відділи, а решта тіла обережно гомогенізували. Гомогенати центрифугували до залишків тканин гранул, а супернатанти використовували для вилучення загальних ліпідів та вимірювання холестерину методом газової хроматографії. Двотижневе годування HCD призвело до підвищення рівня холестерину в личинках даніо в 2,5 рази (рис. 1). Ці результати дозволяють припустити, що експериментальні умови, використані в експериментах з личинками даніо, про які повідомлялося в нашій попередній роботі [1, 5, 6], призводять до значного підвищення рівня холестерину в рідинах тіла личинок, порівнянному з гіперхолестеринемією, повідомленою для дорослих даніо, які харчуються HCD [1].
з 6 незалежних експериментів; 15–20 личинок об’єднували для кожної точки експериментальних даних у кожному окремому експерименті.
Для вивчення ефекту симвастатину ми спочатку додавали його безпосередньо у воду, про що повідомлялося в короткотермінових дослідженнях [9]. Однак ми виявили, що тривалий вплив симвастатину у воді був токсичним для личинок даніо. Змінення доз симвастатину та віку личинок на початку лікування не сприяло покращенню виживання даніо. Далі ми змішували симвастатин у їжу для риб у дозах від 0,1 до 50 μг на грам їжі (μг/г). Як оцінюють у Методах, доза, наприклад, 10 μг/г симвастатину, що вводиться з їжею даніо, приблизно еквівалентний дозі 50 мг симвастатину, що вводиться пацієнтам. Як показано на малюнку 2, ці дози симвастатину були менш ефективними, ніж очікувалось у короткотермінових дослідженнях, без суттєвої різниці між групою, яка отримувала окремо HCD, та групою, яка отримувала HCD з більшими дозами симвастатину (