Індуковане жовчним кислотою тіло маллорі у печінці миші, заснованої на лікарських засобах
Пітер Фікерт
З кафедр медицини * та патології, † Університет Карла-Францена, Грац, Австрія
Майкл Траунер
З кафедр медицини * та патології, † Університет Карла-Францена, Грац, Австрія
Андреа Фуксбіхлер
З кафедр медицини * та патології, † Університет Карла-Францена, Грац, Австрія
Конні Штумпнер
З кафедр медицини * та патології, † Університет Карла-Францена, Грац, Австрія
Курт Затлукал
З кафедр медицини * та патології, † Університет Карла-Францена, Грац, Австрія
Гельмут Денк
З кафедр медицини * та патології, † Університет Карла-Францена, Грац, Австрія
Анотація
Нещодавно ми продемонстрували, що обструктивний холестаз або годування холевою кислотою (СА) призводить до надмірної експресії CK, що супроводжується аномальним фосфорилюванням у печінці миші; 22, тим не менш, причинно-наслідковий зв'язок між холестазом із затримкою потенційно токсичних жовчних кислот та утворенням MB залишається незрозумілим. Це дослідження було покликане з'ясувати, чи холестаз та жовчні кислоти самі по собі є причинними факторами утворення МБ. Тому ми оцінили вплив обструктивного холестазу шляхом перев’язки загальної жовчної протоки (CBDL) та живлення CA (для імітації затримки основної первинної жовчної кислоти) на цитоскелет IF та утворення MB у чітко визначеній експериментальній моделі миші (тобто препарату -грунтована печінка миші). 2,4,18-21 Повідомляється про докази того, що холестаз та жовчні кислоти відіграють центральну роль у формуванні МБ.
Матеріали і методи
Тварини
Самці швейцарських мишей-альбіносів (штам Him OF1 SPF) були отримані з Інституту лабораторних досліджень тварин Медичного факультету Віденського університету, Гімберг, Австрія, в приміщенні з 12:12-годинним циклом світло-темно та дозволеним споживанням води та стандартна дієта для мишей (Марек, Відень, Австрія). Експерименти проводили з 2-місячними мишами вагою від 25 до 30 г. Експерименти були схвалені місцевим комітетом з етики та відповідали критеріям, викладеним у Керівництві по догляду та використанню лабораторних тварин, підготовленому Національною академією наук США, опублікованому Національним інститутом охорони здоров'я (публікація NIH 86-23, переглянутий 1985). CA та DDC були отримані від Aldrich (Steinheim, Німеччина).
Інтоксикація DDC
Мишей годували дієтою, що містила 0,1% ДДК, протягом 2,5 місяців для індукції МВ. 2,4 Після цього періоду часу одну групу тварин приносили в жертву для оцінки DDC-індукованих цитоскелетних змін, включаючи утворення MB, тоді як іншу групу жертвували через 4 тижні після припинення годівлі DDC для вивчення оборотності цих змін, як описано раніше. 4 Крім того, відновленим грунтованим мишам пропонували раціон, що містив 0,1% DDC протягом 7 днів, або піддавали годуванню CBDL або CA (див. Малюнок 1 ▶ для експериментальної конструкції).
Експериментальна конструкція для вивчення ролі холестазу та жовчних кислот у утворенні MB у мишей, грунтованих лікарськими засобами. Мишей годували контрольною дієтою або дієтою з додаванням 0,1% DDC протягом 2,5 місяців, щоб викликати MB. Одну групу тварин приносили в жертву для вивчення індукованих DDC цитоскелетних змін (включаючи утворення MB), тоді як іншу групу жертвували через 4 тижні після припинення годівлі DDC (відновлення) для оцінки оборотності цих змін. Крім того, відновлені (грунтовані) миші отримували контрольну дієту (Co) або їх піддавали повторному годуванню DDC (DDC), CBDL, годуванню CA та підробним операціям протягом 7 днів відповідно. У кожній групі вивчали по п’ять тварин.
Всі хірургічні втручання проводились у стерильних умовах. Для вивчення ефектів обструктивного холестазу на експресію CK та утворення MB у мишей, грунтованих лікарськими засобами, загальну жовчну протоку перев'язували близько до хілуму печінки безпосередньо під біфуркацією та розтинали між лігатурами, як описано раніше. 23 Крім того, холецистектомія проводилась після перев’язки кістозної протоки. Елементи контролю пройшли фіктивну операцію з оголенням, але без перев'язки загальної жовчної протоки та видалення жовчного міхура. Печінку вирізали під загальним наркозом (10 мг авертину внутрішньовенно) через 7 днів після операції. Зразки тканин печінки заморожували у рідкому азоті для молекулярного аналізу та імунофлуоресцентної мікроскопії або фіксували у 4% -ному нейтральному буферному розчині формальдегіду для світлової мікроскопії та імуногістохімії. Зразки сироватки від кожної миші зберігали при -70 ° C для аналізу аспартатамінотрансферази/аланінамінотрансферази, лужної фосфатази та загальних рівнів жовчних кислот.
Годування жовчокислотою
Для вивчення впливу жовчних кислот на експресію CK та утворення MB, мишей, грунтованих лікарськими препаратами, годували дієтою з доповненням СА (1%) протягом 7 днів. 22,24 Печінка та сироватки були оброблені, як описано вище.
Визначення номерів копій мРНК
Номери копій мРНК для CK 8, CK 18 та гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази визначали шляхом конкурентної ланцюгової реакції зворотної транскриптази-полімерази. 10
Вестерн-блотинг CK 8 і CK 18
Рівні білка CK 8 і CK 18 визначали за допомогою Вестерн-блот-аналізу. 4,22
Імунофлуоресцентна мікроскопія
Імунофлуоресцентну мікроскопію проводили на заморожених зрізах печінки (товщиною 3 мкм, фіксували в ацетоні при -20 ° C протягом 10 хвилин) з використанням моноклонального антитіла MM120-1, специфічно розпізнаючи MB і антитіло до поліклонального кролячого CK 50K160 проти CK 8 і CK 18 як описані раніше. 4,22,25 Крім того, фосфорилювання CK 8 оцінювали за допомогою антитіла 5B3 проти гіперфосфорильованого епітопу CK 8. 4,26 Проводили подвійне імуномічення, комбінуючи моноклональні антитіла MM120-1 або 5B3 з поліклональним антитілом 50K160. В якості вторинних антитіл використовували кон'югований з Cy2 козячий IgG проти мишей (Amsersham, Бакінгемшир, Великобританія) та кон'югований свинячий анти-кролячий Ig (DAKO, Glostrup, Данія). Для контролю первинні антитіла були пропущені або замінені відповідними ізотипу імуноглобулінами (DAKO). Імунофлуоресцентні зразки аналізували за допомогою лазерного скануючого конфокального приладу MRC 600 (Bio-Rad, Richmond, CA), прикріпленого до мікроскопа Zeiss Axiophot. Флуоресцентні зображення були зібрані за допомогою конфокальної фотопомножувальної трубки при повнокадровому 768 × 512 пікселів).