Інфекція цитомегаловірусом призводить до дисфункції мікросудин і загострюється

Михайло Васильович Хоретоненко

* Кафедра молекулярної та клітинної фізіології, Центр наук про здоров'я університету штату Луїзіана, Шривпорт, штат Луїзіана

† Центр молекулярної та пухлинної вірусології, Центр наук про здоров’я Університету штату Луїзіана, Шривпорт, Луїзіана

Ігор Л.Лєсков

* Департамент молекулярної та клітинної фізіології, Центр наук про здоров'я університету штату Луїзіана, Шривпорт, штат Луїзіана

Стівен Р. Дженнінгс

‡ Департамент мікробіології та імунології, Центр наук про здоров’я Університету штату Луїзіана, Шривпорт, Луїзіана

§ Кафедра мікробіології та імунології Медичного коледжу Університету Дрекселя, Філадельфія, Пенсільванія

Андрій Д. Юрочко

Карен Ю. Стокс

† Центр молекулярної та пухлинної вірусології, Центр наук про здоров’я університету штату Луїзіана, Шривпорт, Луїзіана

Анотація

З точки зору серцево-судинних захворювань також слід зазначити, що ступінь захворювання пов'язана з навантаженням на фактор ризику. 41 Оскільки пацієнти, як правило, не звертаються до кардіолога через CMV-інфекцію, слід враховувати можливість того, що CMV синергізується з іншими факторами серцево-судинного ризику для індукції мікросудинного запалення. Такий сценарій підтверджується дослідженнями, які показують, що інфекція mCMV прискорила розвиток атеросклерозу у гіперліпідемічних мишей. 42–45 У цих дослідженнях використання генетично гіперліпідемічних мишей вимагало введення mCMV, коли вони вже ставали гіперхолестеринемічними, однак більшість людей заражаються CMV протягом раннього дитинства до того, як рівень холестерину в крові циркулює. Тому друга частина нашого дослідження була розроблена для того, щоб визначити, чи посилює попередня наявність інфекції mCMV, спричинену HC, мікросудинну дисфункцію і чи впливає час цієї гіперхолестеринемії щодо інфекції mCMV на цей синергізм.

Матеріали і методи

Вірус

Запас штаму Сміта mCMV вирощували на клітинах NIH3T3. Потім супернатант і вміст клітин очищали і концентрували на градієнті сахарози, і вірус титрували (у вигляді 8 × 10 7 одиниць, що утворюють бляшки), використовуючи стандартний аналіз нальоту на клітинах NIH3T3, як описано раніше, 46 аликвотами і зберігали при - 80 ° C до необхідності. Фіктивний інокулят аналогічно готували з використанням неінфікованих клітин NIH3T3.

Тварини

Тромбоцити

Приблизно 0,9 мл крові збирали від миші-донора через сонну артерію в 0,1 мл кислоти-цитрат-декстрози (Sigma Chemicals Co., Сент-Луїс, Міссурі). Донори тромбоцитів відповідають джерелу реципієнтів з точки зору інфекції та дієти. Тромбоцити виділяли низкою етапів центрифугування та флуоресцентно мітили, як описано раніше. Ця методика не призводить до активації тромбоцитів, як оцінюють за допомогою експресії Р-селектину. 47 Тромбоцити вважалися засолюючими, якщо вони тимчасово робили паузу (≥2 секунди, але 2 .

Експериментальний протокол

Досліджували посткапілярні венули (діаметром 20–40 мкм) зі швидкістю зсуву стінки ≥500/с. Цей поріг був обраний на основі попередніх звітів, що описують схильність лейкоцитів і тромбоцитів до прилипання у венулах при низькій швидкості зсуву стінки. 48 Щоб уникнути упередженості та запалення внаслідок хірургічної травми, для дослідження було обрано венулу з найменшою кількістю прилипаючих та емігруючих лейкоцитів наприкінці 30 хвилин стабілізації. Тромбоцити (10 8, в обсязі 120 мкл) вводили через яремну вену протягом 5 хвилин і давали циркулювати ще 5 хвилин. Однохвилинні записи лейкоцитів (світлова мікроскопія) з подальшим 1-хвилинним записом тромбоцитів (флуоресцентна мікроскопія) були зроблені перших 100 мкм кожні 300 мкм вздовж довжини нестимульованої посудини, починаючи поблизу джерела венулу, наскільки це можливо. Розраховували середнє значення кожної змінної в межах однієї венули та проводили порівняння між експериментальними групами.

Після того, як були зібрані дані про венулах, тваринам давали можливість стабілізуватися протягом 20–30 хвилин, і для дослідження обрали артеріоли з діаметром від 15 до 40 мкм і швидкістю зсуву стінки ≥ 500/с. Діаметр та Vrbc вимірювали на вибраних ділянках до та після суперфузії з 10-5 М ендотелію залежного вазодилататора, ацетилхоліну (ACh), протягом 5 хвилин. Діаметри артеріол дозволили повернутися до вихідних значень за допомогою сольової суперфузії, забуференної бікарбонатом, перед тим, як застосовувати папаверин (папав) для тесту на максимальне незалежне від ендотелію розширення судин. Реакції вазорелаксації артеріолярних судин виражались як відсоток зміни діаметра в порівнянні з вихідним рівнем. Артеріоли, які не реагували на папав, були виключені з дослідження.

Рівні холестерину в сироватці крові

Сироватку заморожували для подальшого вимірювання рівня холестерину за допомогою спектрофотометричного аналізу (Sigma Chemicals Co.).

Кількість клітин крові

В кінці експерименту забирали кров з серця на вміст лейкоцитів (з використанням кришталево-фіолетового забарвлення) та кількості тромбоцитів (із використанням системи унопетт; BD Biosciences, Сан-Хосе, Каліфорнія) за допомогою гемоцитометра.

Аналізи нальоту

Клітини NIH3T3 розмножувались у середовищі DMEM із 10% фетальної бичачої сироватки та 1: 100 пеніциліну/стрептоміцину та пасирували із кратністю 5–10. Для аналізу нальоту на клітинах клітини вирощували до 90% злиття на 48-лункових планшетах для культури тканин. Зразки слинних залоз, печінки, селезінки (первинні органи розповсюдження) та кремастерних м'язів (використовуваних для спостереження за мікросудин) від мишей, інфікованих mCMV ± HC, аналізували за допомогою стандартного аналізу нальоту (4–7 на групу). Тканини зважували та гомогенізували у збалансованому розчині солі Хенкса з 0,1% плодовою бичачою сироваткою (Об'єм [мкл] = маса тканини [мг] × 10), сміття видаляли центрифугуванням та тричі 10-разовими розведеннями супернатантів з кожен зразок додавали до моношарів 3T3 (у двох примірниках). Пластини інкубували при 37 ° C протягом 1–1,5 години, накладали метилцелюлозу, і бляшки підраховували через 4–5 днів після зараження. Як негативний контроль використовували фальшиві середовища та гомогенати макетів. Серійні розведення вірусів з відомим титром та відомі титри вірусів, додані до макетних зразків печінки перед гомогенізацією, використовувались як позитивний контроль (титри вірусів відповідали кількості вірусу, доданого в тканину/лунку).