Інсулін активує RSK (p90 рибосомальна S6-кіназа), щоб викликати нову петлю негативного зворотного зв’язку, яка
Ніколас Смаджа-Ламер
Із Інституту серця та легенів Квебеку, Університет Лаваля, 2705 Чемін Сте-Фой, Сте-Фой (Квебек) G1V4G5, Канада,
Михайло Шум
Із Інституту серця та легенів Квебеку, Університет Лаваля, 2705 Чемін Сте-Фой, Сте-Фой (Квебек) G1V4G5, Канада,
Пол Делеріс
§ Інститут досліджень імунології та раку (IRIC) та
Філіп П. Ру
§ Інститут досліджень імунології та раку (IRIC) та
¶ кафедра патології та клітинної біології медичного факультету університету Монреаля, Монреаль, Квебек H3C 3J7, Канада, та
Джун-Ічі Абе
Medical Медичний центр Рочестерського університету, ACVRI, Нью-Йорк 14642
Андре Маретт
Із Інституту серця та легенів Квебеку, Університет Лаваля, 2705 Чемін Сте-Фой, Сте-Фой (Квебек) G1V4G5, Канада,
Анотація
Вступ
Тут ми описуємо нову петлю негативного зворотного зв'язку, за допомогою якої інсулін активує RSK, який сприяє фосфорилюванню IRS-1 на Ser-1101, незалежно від шляху mTOR/S6K1. Це, в свою чергу, обмежує передачу сигналів інсуліну та метаболізм глюкози в скелетних м’язах та печінкових клітинах.
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ ПРОЦЕДУРИ
Реактиви та антитіла
DMSO, рибний желатин та рапаміцин були від Sigma-Aldrich. BI-D1870 був від комплексу MSI/WTB в Університеті Данді, Великобританія. PF-4708671 був від компанії Symansis (Timaru, NZ). Інсулін отримував Eli Lilly (Торонто, Онтаріо, Канада). Антитіла проти IRS1, анти-G6Pase, анти-PGC1α та анти-RSK були від компанії Santa Cruz Biotechnology Inc. (Санта-Крус, Каліфорнія). Антифосфо-RSK Ser-221 та Ser-380 були від Abcam (Кембридж, Массачусетс). Антифосфо-IRS-1 Ser-1101 та Ser-636/9; антифосфо-S6K1 Thr-389, антифосфо-GSK3 Ser-21/9, анти-GSK3, анти-фосфо-Foxo Ser-256, анти-Foxo, анти-фосфо-мотор Ser- 2448 та анти-AKT Ser-473 були від Cell Signaling Technologies (Danvers, MA). Антитубулін був від Sigma-Aldrich. Антитіло p85 було від Millipore (Сан-Франциско, Каліфорнія). Анти-PEPCK був від Cayman Chemical (Ен Арбор, Мічиган). Домінантний негативний RSK1 (RSK1-DN) та аденовіруси LacZ вже були описані (22).
Культура клітин
Міобласти L6 вирощували в α-MEM (Invitrogen) з додаванням 10% FBS і диференціювали в міотрубки в α-MEM з 2% FBS, як описано раніше (27). Клітини HepG2 вирощували в DMEM (Invitrogen). Клітини L6 та HepG2 позбавляли сироватки протягом 4 год до експерименту, а 100 н м інсуліну використовували для стимуляції клітин протягом останньої години депривації. Гепатоцити ФАО утримувались у середовищі RPMI (Invitrogen). Клітини FAO позбавляли сироватки протягом ночі та стимулювали зазначеною концентрацією інсуліну.
Західні аналізи
Вестерн-блотування проводили, як описано (23). Коротко кажучи, рівні кількості білка відокремлювали SDS-PAGE (9%) і переносили на нітроцелюлозну мембрану. Мембрани блокували у 5% рибному желатині, розведеному в PBS, рН 7,4, 0,1% Tween (PBS-T), та інкубували протягом ночі з відповідними антитілами, розведеними в 1% рибному желатині в PBS-T. Імунопреципітації проводили, як описано з незначними змінами (24). Загальний лізат клітин (500 мкг) попередньо очистили білком A-сефарозою та імунопреципітували відповідними антитілами, зчепленими з білком A-сефарозою.
2-дезоксиглюкоза (2-DG)
Використовували процедури поглинання 2-DG, як описано раніше (25). Коротше кажучи, клітини інкубували протягом 8 хв у забуференному HEPES фізіологічному розчині, що містив 10 мкм немеченої 2-DG і 10 мкм d -2-дезокси- [3 H] глюкози (0,5 мкКі/мл). Реакцію припиняли промиванням тричі холодним 0,9% NaCl (мас./Об.). Клітинно-асоційовану радіоактивність визначали шляхом лізису клітин 0,05 N NaOH з подальшим рідинним сцинтиляційним підрахунком і нормалізували до концентрації білка.
Аналізи білкової фосфотрансферази
Виробництво глюкози
Клітини FAO інкубували 16 год у безсироватковому середовищі, з інсуліном або без нього (100 н м). Клітини тричі промивали PBS і інкубували без фенолу та безглюкози середовище DMEM, доповнене 20 м м 1 -лактатом натрію та 2 м м піруватом натрію протягом 5 год з інсуліном або без нього. Клітинні супернатанти збирали, і концентрацію глюкози вимірювали за допомогою набору для аналізу глюкози Amplex-Red відповідно до інструкцій виробника (Invitrogen). Клітини лізували 50 м м NaOH і визначали концентрацію білка за допомогою набору для аналізу білка BCA для нормалізації вироблення глюкози.
Кількісна оцінка та статистичний аналіз
Вестерн-блот визначали кількісно за допомогою програмного забезпечення Quantity One версії 4.6.9 (Bio-Rad). Одно- і двосторонній ANOVA з Boneferonni або Tuckey post hoc і t-тести проводили з GraphPad Prism версії 5.0a для Mac (GraphPad Software).
РЕЗУЛЬТАТИ
Нечутливий до рапаміцину кіназа фосфорилює IRS-1 при нормальних концентраціях АА
Як було показано раніше (4), інсулін стимулює фосфорилювання IRS-1, головним чином, через рапаміцин-чутливу кіназу в умовах перевантаження поживними речовинами, наприклад надлишку АА (див. Молекулярний зсув IRS-1, запобіжений рапаміцином при 2 × АА умови, рис. 1 А). Однак при низьких до нормальних концентраціях амінокислот (0–1 × AA) рапаміцин мав лише незначний вплив на індукований інсуліном вищий молекулярний зсув IRS-1, що припускає, що mTORC1/S6K1 не відповідає за зміну рухливості. Ці результати також вказують на те, що інші кінази можуть фосфорилювати IRS-1 за відсутності перевантаження АА (див. Умови 0–1 × АА, рис. 1 А). Уздовж однієї лінії на фосфорилювання RSK не впливають різні концентрації амінокислот або рапаміцин (рис. 1 А).
RSK1 Фосфорилює IRS-1на Ser-1101
Проаналізувавши амінокислотну послідовність IRS-1, ми відзначили, що пептидне середовище навколо Ser-1101 зберігається протягом всієї еволюції і відповідає мотиву фосфорилювання типу 1, присутнім у багатьох субстратах RSK (RXRXX-pS/T-XXX, див. легенда рисунка для деталей; рис. 1, В та В). Потім ми шукали в послідовності IRS-1 людини наявність цього консенсусного мотиву і виявили 5 передбачуваних серинових залишків IRS-1, присутніх у мотиві фосфорилювання RSK (рис. 1 D).