Інтерлейкін-6 викликає втрату жиру при кахексії раку, сприяючи ліполізу білої жирової тканини та
Анотація
Передумови
Кахексія раку - це прогресуючий та багатофакторний метаболічний синдром, що характеризується втратою жирової тканини та скелетних м’язів. Пропонується ліполіз білої жирової тканини (WAT) та трансдиференціація білого до коричневого кольору WAT (підрум’янення WAT), що сприяє атрофії WAT при кахексії раку. Повідомлялося, що хронічне запалення, опосередковане цитокінами, такими як фактор некрозу пухлини альфа (TNF-α) та інтерлейкін-6 (IL-6), сприяє кахексії раку. Однак чи сприяє хронічне запалення раковій кахексії, регулюючи метаболізм WAT та основний механізм залишається незрозумілим.
Методи
У цьому дослідженні ми вперше проаналізували зв'язок між хронічним запаленням та метаболізмом ВАТ у кахектичних хворих на рак шлунку та колоректального раку. У кахектичних мишей, які отримували антитіла до рецептора IL-6, ми з’ясували, чи регулюється IL-6 ліполіз та побуріння WAT.
Результати
Клінічні аналізи показали позитивний значущий зв'язок між сироватковим IL-6 та вільними жирними кислотами (FFA) як на ранній, так і на пізній стадії кахексії раку. Однак TNF-α у сироватці крові позитивно асоціювався з FFA у сироватці крові на ранній, але не на пізній стадії кахексії. WAT-ліполіз був збільшений на ранній та пізній стадії кахексії, тоді як підрум'янення WAT було виявлено лише на пізній стадії кахексії. Антитіло до IL-6-рецептора пригнічувало WAT-ліполіз та побуріння у кахектичних мишей.
Висновки
На основі цих висновків ми робимо висновок, що хронічне запалення (особливо те, що опосередковується IL-6) може сприяти кахексії раку шляхом регулювання ліполізу WAT на ранній стадії кахексії та побуріння на пізній стадії кахексії.
Передумови
Кахексія раку - це синдром марнотратства, що визначається постійною втратою скелетних м’язів та жирової маси, яку неможливо повністю повернути за допомогою звичайної харчової підтримки [1]. Кахексія раку зустрічається приблизно у 80% онкологічних хворих і є основною причиною смерті у 22–30% усіх онкологічних хворих [2, 3]. Кахексія раку значно знижує толерантність до протипухлинної терапії та знижує якість життя [4, 5]. Однак у хворих на рак зазвичай не діагностують кахексію, поки вони не втратять більше 5–7% маси тіла через відсутність ефективних маркерів раннього виявлення [6]. Тому існує гостра необхідність зрозуміти основні механізми ракової кахексії, щоб проінформувати про розробку нових діагностичних та терапевтичних цілей.
Хоча втрата м’язів є ознакою ракової кахексії, основний катаболічний драйвер кахексії раку включає не лише протеолітичний розпад скорочувальних м’язових білків. Виснаження жирової тканини також сприяє руйнівному впливу ракової кахексії [7]. Як повідомляється, втрата жирової тканини пов’язана зі зниженням якості життя та коротким виживанням, незалежно від індексу маси тіла (ІМТ) у хворих на рак, що прогресують [8, 9]. Посилений ліполіз і окислення жиру, знижений ліпогенез, порушення відкладення ліпідів і адипогенезу, а також побуріння білої жирової тканини (ВАТ) можуть бути основою атрофії жирової тканини при кахексії раку [10].
Хронічне запалення, яке опосередковується інтерлейкіном-6 (IL-6) та фактором некрозу пухлини альфа (TNF-α), широко досліджувалось як важливий регулятор втрати жиру при раковій кахексії [3, 10]. Однак зв’язок між запальними цитокінами та ліполізом WAT та побурінням у кахектичних пацієнтів також рідко повідомляється. Чи сприяють запальні цитокіни зниженню жирової тканини при раковій кахексії, прискорюючи ліполіз та коричневіння ВАТ, залишається незрозумілим.
У цьому дослідженні ми виявили WAT-ліполіз та побуріння у підшкірній WAT кахектичних пацієнтів із раком шлунка та прямої кишки. Взаємозв'язок між запальними цитокінами та ліполізом WAT та побурінням також аналізувались у кахектичних пацієнтів. Вплив IL-6 на WAT-ліполіз та побуріння аналізували на кахектичних мишах.
Методи
Пацієнти та збір проб
Підшкірні ВАТ збирали під час хірургічного втручання у пацієнтів з раком шлунка та прямої кишки в лікарні Чжуншань університету Фудань протягом 1 січня 2014 року по 31 грудня 2016 року. Діагнози злоякісного захворювання підтверджувались післяопераційними патологічними дослідженнями. Критерії виключення були такими: 1) пацієнт віком 10% за останні 6 місяців.
Підшкірні ВАТ розрізали на половинки, і один шматок негайно заморозили в рідкому азоті і зберігали при -80 ° С до подальшого аналізу, тоді як іншу половину фіксували в 10% формаліні і вкладали в парафін. Зразки крові всіх пацієнтів відбирали перед операцією та негайно центрифугували при 3000 об/хв протягом 15 хв при 4 ° C. Зразки сироватки зберігали при -80 ° C для подальшого аналізу. Були записані клінічні характеристики кожного пацієнта до операції, включаючи вік, стать та ІМТ.
Експериментальна модель кахексії та методи лікування
Мишей-самців BALB/c (віком 6–8 тижнів) вагою 16–20 г придбали у Шанхайському лабораторному центрі тварин при Китайській академії наук. Мишей утримували при 22 ± 1 ° C з 12-годинним циклом світло/темрява і мали вільний доступ до води та звичайної дієти. Мишей акліматизували в навколишньому середовищі за 1 тиждень до початку дослідження. Всі маніпуляції з тваринами проводились відповідно до керівних принципів та правил використання експериментальних тварин Китайською академією наук. Всі зусилля були зроблені для мінімізації страждань тварин і використання лише тієї кількості тварин, яка необхідна для отримання надійних наукових даних.
Клітини ободової кишки 26/клону 20, які, як повідомляється, індукують сильну кахексію у мишей BALB/c шляхом підшкірного посіву, культивували в Меморіальному інституті Розуелл Парк (RPMI) -1640, доповненому 5% плодовою бичачою сироваткою та 1% пеніцилін-стрептоміцином при 37 ° C у 5% CO2. Мишей випадковим чином розподіляли до трьох експериментальних груп: контрольної групи, групи, що несе пухлину Colon 26, та антитіл до рецепторів проти IL-6 (eBiosciences, CA, USA), які отримували пухлину. У дослідний день 0, 1,0 × 10 6 клітин, суспендованих у 100 мкл забуференного фосфатом сольового розчину (PBS), вводили підшкірно в праву пахву мишей у групі, яка обробляла пухлини та антитіла до рецепторів проти IL-6. В контрольну групу вводили рівний об’єм PBS без пухлинних клітин. У групі, яка отримувала антитіла до рецепторів IL-6, кожна миша отримувала інтраперитонеальну ін’єкцію 10 мкг моноклонального антитіла до рецептора IL-6, розведеного в 200 мкл фізіологічного розчину кожні 2 дні. Контрольна група та групи, що несуть пухлину, отримували 200 мкл PBS. На 16 день мишей забивали через вивих шийки матки. Збирали та зважували підшкірну пахову та епідидимальну ВАТ, міжлопаткову БАТ та шлунково-м’язовий м’яз. Зразки розрізали на половинки, обробили та зберігали, як це було зроблено з людськими зразками ВАТ.
Імуногістохімія та морфологічний аналіз
Підшкірні ВАТ людини та миші, вбудовані в парафін, розрізали на ділянки по 5 мкм. Імунозабарвлення UCP1 всіх тканин проводили, як описано раніше [19]. Коротко, предметні стекла зневоднювали у сортових спиртах та ксилолі. Визначення антигену проводили 0,01 М цитратним буфером при 95 ° С протягом 20 хв при рН 6,0. Слайди інкубували з розведеними первинними антитілами (анти-UCP1, розведення 1: 100) протягом 12 годин. Потім предметні стекла інкубували з біотинільованим вторинним антитілом протягом 1 год, міченим пероксидазою стрептавідином протягом 15 хв, а також підкладкою діамінобензидину та перекису водню хромогену та підсилювачем діамінобензидину протягом 10 хв з наступним фарбуванням гематоксиліном Майєра. Зображення отримували за допомогою об'єктива × 40. Розміри адипоцитів WAT були відстежені та визначені кількісно за допомогою програмного забезпечення ImageJ.
ПЛР-аналіз у реальному часі
Загальну РНК виділяли з підшкірної ВАТ людини та миші за допомогою реагенту TRIzol (Invitrogen, Каліфорнія, США) відповідно до рекомендацій виробника. Концентрації РНК визначали кількісно за допомогою спектрофотометра NanoDrop 2000, а цілісність визначали за допомогою гель-електрофорезу. Комплементарну ДНК синтезували з 1 мкг загальної РНК за допомогою набору для синтезу кДНК (Takara, Далянь, Японія) за протоколами виробника. Аналіз експресії генів проводили за допомогою основного сумішу PrimeScript RT (Takara, Далянь, Японія) в системі реального часу StepOnePlus (Applied Biosystems, CA, USA). Відносні рівні експресії генів розраховували за допомогою 2 -Ct і порівнювали з 18sRNA як внутрішній контроль. Використовувані праймери наведені в таблиці 1.