Як працює хроматографія з іонообмінною технологією; Новини-Медичні
Іонообмінна хроматографія (IEX) - це техніка, яка зазвичай використовується при очищенні біомолекул. Він передбачає поділ молекул на основі їх заряду.
Цей метод використовує взаємодію між зарядженими молекулами у зразку та протилежним чином зарядженими фрагментами у канцелярській фазі хроматографічної матриці. Цей тип поділу важко застосовувати за допомогою інших методів, оскільки зарядом легко управляти за допомогою рН використовуваного буфера.
Можливе виділення іонообмінних типів двох типів - катіонообмін та аніонообмін. При аніонообміні стаціонарна фаза заряджена позитивно, тоді як при катіоні - негативно.
Принцип іонообмінної хроматографії
IEX-хроматографія використовується для розділення заряджених біомолекул. Неочищений зразок, що містить заряджені молекули, використовується як рідка фаза. Коли він проходить через хроматографічну колонку, молекули зв'язуються з протилежно зарядженими ділянками в нерухомій фазі.
Молекули, розділені на основі їх заряду, елююються за допомогою розчину з різною іонною силою. Пропускаючи такий розчин через колонку, відбувається високоселективне розділення молекул за різними зарядами.
Техніка
Основні етапи процедури іонообмінної хроматографії перелічені нижче:
- Зразок нечистого білка завантажується в колонку іонообмінної хроматографії при певному рН.
- Заряджені білки будуть зв'язуватися з протилежно зарядженими функціональними групами смоли
- Для елюювання відокремлених білків використовується градієнт солі. При низькій концентрації солі елююються білки з кількома зарядженими групами, а при більш високих концентраціях солі елююються білки з кількома зарядженими групами.
- Небажані білки та домішки видаляються промиванням колонки.
Градієнт рН може також застосовуватися для елюювання окремих білків на основі їх ізоелектричної точки (pI), тобто точки, в якій амінокислоти в білку несуть нейтральний заряд і, отже, не мігрують в електричному полі. Оскільки амінокислоти є цвіттер-іонними сполуками, вони містять групи, що мають як позитивні, так і негативні заряди. Виходячи з рН середовища, білки несуть позитивний, негативний або нульовий заряд. У своїй ізоелектричній точці вони не будуть взаємодіяти із зарядженими фрагментами смоли колони, а отже, елююються. Знижувальний градієнт рН може використовуватися для елюювання білків за допомогою аніонообмінної смоли, а зростаючий градієнт рН може використовуватися для елюювання білків із катіонообмінних смол. Це пояснюється тим, що збільшення рН буфера рухомої фази призводить до того, що білок стає менш протонованим (менш позитивно зарядженим), тому він не може утворювати іонну взаємодію з негативно зарядженою смолою, що дозволяє елююватися. І навпаки, зниження рН рухомої фази призведе до того, що молекула стане більш протонованою (менш негативно зарядженою), що дозволить її елюції.