Канал Mergla K викликає атрофію скелетних м’язів, активуючи шлях протеїсоми убиквітину -

Кафедра основних медичних наук, Школа ветеринарної медицини, Університет Перд'ю, Вест-Лафайєт, штат Індіана, США

Кафедра медичної хімії та молекулярної фармакології, Фармацевтичний коледж, Університет Пердью, Вест-Лафайєтт, штат Індіана, США

Департамент ветеринарних клінічних наук, Школа ветеринарної медицини, Університет Пердю, Вест-Лафайєт, штат Індіана, США

Кафедра ветеринарної патобіології, Центр раку, Університет Пердью, Вест-Лафайєтт, штат Індіана, США

Департамент наук про тварин, сільськогосподарський коледж, Університет Пердью, Вест-Лафайєт, штат Індіана, США

Інститут серцево-судинної системи, Університет Пітсбурга, Пітсбург, штат Пенсільванія, США

Ці автори не менш сприяли цій роботі. Шукайте більше статей цього автора

Ці автори не менш сприяли цій роботі. Листування: Школа ветеринарної медицини, Університет Пердью, 625 Гаррісон Сент, Вест Лафайєтт, ІН 47907, США. Електронна пошта: [email protected] Шукати інші статті цього автора

Кафедра ветеринарної патобіології, Центр раку, Університет Пердью, Вест-Лафайєтт, штат Індіана, США

Інститут серцево-судинної системи, Університет Пітсбурга, Пітсбург, штат Пенсільванія, США

Ці автори не менш сприяли цій роботі. Шукайте більше статей цього автора

Ці автори не менш сприяли цій роботі. Листування: Школа ветеринарної медицини, Університет Пердью, 625 Гаррісон Сент, Вест Лафайєтт, ІН 47907, США. E-mail: [email protected] Шукати більше статей цього автора

АНОТАЦІЯ

Атрофія S скелетних м’язів, зменшення вмісту скорочувального білка та м’язової сили, може бути наслідком пошкодження м’язів, захворювань, зникнення або старіння (1–4); наслідки виснаження можуть серйозно погіршити якість життя. Фізична терапія та введення факторів росту (5), інгібіторів протеолізу (6) або стимуляторів синтезу білка (7) є методами, що вивчаються для лікування атрофії; однак необхідні більш ефективні методи лікування. Шлях протеасоми убиквітину (UPP), за допомогою якого білкові субстрати деградуються (8), є важливим серед механізмів, відомих для модуляції атрофії скелетних м’язів; однак про фактори, що активують цей шлях, відомо мало.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Тварини Усі процедури були затверджені Комітетом з догляду та використання тварин Пердю. Мишей ND4-Swiss Webster (Harlan-Sprague, Indianapolis, IN) використовували у всіх процедурах, за винятком досліджень пухлин, на яких застосовували мишків атимуса (NCr-nu; Harlan-Sprague). Тварин розміщували в університетах Пердью, контролювали лабораторні ветеринари-тварини та забезпечували їжу та воду за бажанням.

Підвіска задньої кінцівки

Спеціальні підвісні клітини були побудовані, як описано раніше (16). Мишей поміщали в ці клітини, відпочиваючи приблизно на 30 ° нахилом голови вниз із піднятими задніми кінцівками, так що вони не могли покласти жодних навантажень на задні кінцівки. Контрольних мишей утримували в клітинах для комерційних мишей у нормальному стані несучої маси.

Індукція пухлини

Кб клітин раку стравоходу людини (7000 клітин/100 мкм середовища RPMI з 10% FBS і 1% глютаміном; 17) імплантували підшкірно (с. С.) В праву пахву мишей (= 8; NCr ‐ nu; Harlan ‐ Sprague). Контрольні миші (= 8) вводили транспортний засіб. Мишей зважували щотижня протягом 6 тижнів. Пухлини вимірювали цифровим штангенциркулем щотижнево.

Вестерн-блот

Для імуноблотів мембранні білки витягували з м’язів шлунково-кишкового мозку та мозку (14). Зразки імуноблотували за допомогою антитіла erg1 (Ab) (14). Після промокання мембрани фарбували 0,1% Coomassie R ‐ 250, щоб підтвердити, що зразки мембран містять однаковий білок.

Зрізи тканин і фарбування

М'язи шлунково-кишкового тракту були підготовлені та кріосекціоновані (14 мкм), як описано раніше (16). Зрізи фарбували на активність β-галактозидази (lacZ) (16) або імунозабарвлювали (16), використовуючи erg1 Ab (14), за винятком випадків, коли зазначено. Зображення зрізів були зроблені цифровою камерою Leaf Micro-Lumina (Scitex; Тель-Авів, Ізраїль). Кількість пікселів кожного перерізу м’язового волокна визначали (Adobe Photoshop 6) і перетворювали на мкм 2. Були проаналізовані два зрізи (по 50 волокон у кожному) з кожного середнього відділу м’яза.

Плазміди

Клони Mergla (10), Merg1b (10) та DN ‐ Mergla (G628S; 15) знаходились у pBK/цитомегловірусі (CMV). Уцивілізована люцифераза світлячка (Ub-FL) у pGL ‐ 3/CMV була подарована доктором Девідом Півникою-Вормсом (18; Вашингтонський університет, Сент-Луїс, Міссурі). CMV ‐ nlacZ у векторі pNL був придбаний у Centre Commercial de Gros (Тулуза, Франція). PHRL синтетичний Ренілла репортерний вектор люциферази (RL) був придбаний у ProMega (Madison, WI).

Електропорація

Мишей знеболювали 0,01 мкл/мг маси тіла ксилазину (1 мг/мл) та кетаміну (9 мг/мл) у стерильному фізіологічному розчині. Гастрокнеміальним м’язам поголених задніх кінцівок вводили плазміди та електропорували 8 імпульсів при 200 В/см протягом 20 мс при 1 Герці (19) із позаклітинною матрицею (ECM) 830 ElectroSquare Porator (BTX; Hawthorne, NY).