Координований збудливий вплив ГАМКаергічних інтернейронів на три моторні програми годування в

Анотація

Будь-яка складна поведінка вимагає конкретної координації між різними нейронними мережами, що контролює різні її аспекти, для досягнення значущого поведінкового результату. Така координація забезпечує впорядковане вироблення складної поведінки та представляє універсальний принцип функціонування ЦНС як у хребетних, так і у безхребетних тварин. Основним завданням поточного дослідження є поведінка живлення хижого молюска-птеропода Clione limacina та нейронні механізми координації між основними елементами цієї складної поведінки.

Ми описуємо в цьому дослідженні та обговорюємо роль двосторонньо симетричного церебрального інтернейрону, позначеного клітиною Cr-BM, який справляє помітний збудливий вплив на всі нейронні мережі, які контролюють три основні живильні структури в Кліон: щічні шишки, хітинові гачки та радула. Попередній загальний опис деяких з цих ефектів був раніше опублікований (Norekian 1995). Загальний сильний збудливий вплив, що виробляється нейроном Cr-BM на всі виявлені нейронні мережі, що живляться, є, мабуть, важливим під час періоду «видобутку здобичі» під час годування після захоплення здобичі. На додаток до загальної активації, нейрон Cr-BM має сильний координаційний вплив на окремі елементи кожної нейронної мережі, що сприяє фазової залежності координації їх ритмічної діяльності. Очевидно, що інтернейрон Cr-BM використовує ГАМК як збудливий передавач на основі експериментів подвійного маркування, імітуючи ефект екзогенного ГАМК та блокуючий ефект антагоністів ГАМК. Це представляє ще один цікавий приклад збудливої ролі ГАМК в поведінці годування Кліон (Аршавський та ін., 1993; Норекян, 1999).

Дорослі екземпляри C. limacina були зібрані в лабораторіях П’ятницької гавані Вашингтонського університету (П’ятниця Харбор, Вашингтон) у весняно-літній сезон та в Біломорській морській лабораторії Зоологічного інституту (Біле море, Росія) у літньо-осінній сезон. Тварин утримували в 1-галонних банках у холодильнику при температурі 5–7 ° C. Перед розтином тваринам знеболювали суміш морської води та ізотонічного MgCl2 у співвідношенні 1: 1, а потім щільно прикріплювали до чашки Петрі з силіконовим еластомером (Sylgard). Електрофізіологічні експерименти проводили на редукованих препаратах, що складалися з ЦНС, голови та крил. Всі центральні нерви, що іннервують голову, були цілими. До електрофізіологічного запису оболонку центральних гангліїв пом'якшували, купаючи препарат у розчині протеази 1 мг/мл (Sigma, тип XIV) протягом 5 хв, після чого 30-хвилинним промиванням у фільтрованій морській воді.

Внутрішньоклітинні записи з окремих нейронів проводили за допомогою скляних мікроелектродів (опори: 10–30 МОм), наповнених 2 М ацетатом калію. Електрофізіологічні сигнали посилювались, відображались та реєструвались за допомогою звичайних електрофізіологічних методів. Внутрішньоклітинна стимуляція була досягнута за допомогою мостової схеми підсилювача. Для тестування на моносинаптичні сполуки використовували високодивалентний розчин катіону [що містить (в мМ) 110 MgCl2, 25 CaCl2, 400 NaCl, 10 KCl та 3 NaHCO3, рН 7,4]. Для морфологічного дослідження зареєстрованих нейронів 5% розчин 5 (6) -карбоксифлуоресцеїну (Sigma), приготовлений у 2 М ацетаті калію, іонофорували через реєструючі електроди (опори, 20–40 МОм) з негативним струмом від 1 до 10 нА імпульси протягом 5–30 хв. Ін’єкційні клітини спостерігали в прямому ефірі в фіксуючому мікроскопі з епіфлуоресцентним мікроскопом Nikon та конфокальним мікроскопом BioRad (Геркулес, Каліфорнія) MRC 600.

ГАМК застосовували локально до соми ідентифікованих нейронів за допомогою викиду тиску або іонофоретичного застосування. Для викиду тиску скляні мікропіпетки заповнювали 5 мМ розчином ГАМК у відфільтрованій морській воді і підключали до системи тиску повітря (PV830 Pneumatic PicoPump, WPI), яка подавала імпульси тиску 40–60 п.с.і. і тривалістю 200 мс. Фарба Fast Green (0,02%) була додана в розчин для контролю доставки препарату. Для іонофоретичного застосування ми використовували скляні мікропіпетки діаметром кінчика 1–2 мкм, наповнені 1 М розчином ГАМК (pH 4). Іонофоретичні струми мали амплітуду від 50 до 100 нА і застосовувались як короткі імпульси тривалістю від 50 до 100 мс (стимулятор S4KR та модуль ізоляції стимулу SIU 4678, інструменти Grass). Антагоністи ГАМК застосовували за допомогою градуйованої піпетки об’ємом 1 мл. Кінцеву концентрацію оцінювали з відомого об'єму введеного розчину та відомого об'єму сольового розчину у фіксуючу тарілку.

Для експериментів з подвійним маркуванням інтернейронам вводили нейробіотин (Vector Laboratories). Потім препарати фіксували у 4% параформальдегіду та 0,1% глутаральдегіду в PBS та інкубували 12 год у червоно міченому авідині Техасу (Vector Laboratories) для візуалізації інтернейронів, наповнених нейробіотином. Потім препарати обробляли для імуноцитохімічної реакції, описаної в попередньому тексті. Змінивши фільтри у флуоресцентному мікроскопі або лазерному скануючому конфокальному мікроскопі для червоного Техасу та флуоресцеїну, інтернейрони були визначені як ГАМК-імунореактивні. Техаський червоний не видно з флуоресцеїновими фільтрами, а флуоресцеїн не видно з фільтрами техаського червоного, що забезпечує чітке порівняння під час перемикання фільтрів.

Морфологія Cr-BM інтернейрону та загальний вплив на нейронні мережі

Двосторонній симетричний інтернейрон Cr-BM знаходився на вентральній поверхні мозкових гангліїв у передній області між головними нервами N1 та N2, що іннервують голову тварини (рис. 1). Розміри клітинного тіла становили 25–30 мкм у діаметрі. Один великий аксон нейрону Cr-BM вийшов з мозкових гангліїв в іпсилатеральний церебро-щічний сполучний матеріал та іннервував нейропілу обох щічних гангліїв (рис. 1). Кілька дрібних відростків також розгалужуються в нейропілі іпсилатерального мозкового ганглія. Морфологічну структуру 16 інтернейронів Cr-BM вивчали у 12 препаратах після внутрішньоклітинного введення флуоресцентного барвника карбоксифлуоресцеїну.

Фіг. 1.Морфологічна структура правого інтернейрону Cr-BM, що вводиться карбоксифлуоресцеїном. Клітинне тіло розташоване в мозкових гангліях (Cer) поблизу основи головних нервів N1 і N2 і проектує один великий аксон на щічні ганглії (Buc) за допомогою церебро-щічного сполучного (cbc). Мікрофотографію отримували за допомогою епіфлуоресцентного мікроскопа.