Маніпулювання активністю мітохондрій у клітинній лінії печінки Huh7 людини за допомогою низькопотужного лазера
Анна Линник
1 Інститут фізики Чеської академії наук, Прага, 18221, Чехія
Марія Лунова
1 Інститут фізики Чеської академії наук, Прага, 18221, Чехія
2 Інститут клінічної та експериментальної медицини (IKEM), Прага, 14021, Чеська Республіка
Мілан Джирса
2 Інститут клінічної та експериментальної медицини (IKEM), Прага, 14021, Чеська Республіка
Дарія Єгорова
3 Університет ІТМО, Санкт-Петербург, 197101, Росія
Андрій Куликов
3 Університет ІТМО, Санкт-Петербург, 197101, Росія
Шарка Кубінова
1 Інститут фізики Чеської академії наук, Прага, 18221, Чехія
4 Інститут експериментальної медицини Чеської академії наук, Прага, 14220, Чеська Республіка
Олег Лунов
1 Інститут фізики Чеської академії наук, Прага, 18221, Чехія
Олександр Дейнека
1 Інститут фізики Чеської академії наук, Прага, 18221, Чехія
Анотація
Малопотужне лазерне опромінення червоного світла було визнано перспективним інструментом у широкому спектрі біомедичних програм. Однак глибоке розуміння молекулярних механізмів клітинних ефектів, викликаних лазером, залишається важливою проблемою. Тут ми досліджували механізми, що беруть участь у процесі смерті в клітинній печінковій лінії людини Huh7 при лазерному опроміненні. Ми відокремили різні шляхи загибелі клітин, націлені на лазерне опромінення різної потужності. Наші дані демонструють, що високі дози лазерного опромінення демонстрували найвищі рівні загального продукування активних форм кисню, що призводило до пов'язаного з циклофіліном D некрозу через перехід мітохондріальної проникності. Навпаки, низькодозове опромінення лазером призводило до накопичення ядер супероксиду та апоптозу. Наші висновки пропонують нове розуміння клітинних реакцій, викликаних лазером, і виявляють різні шляхи загибелі клітин, викликані лазерним опроміненням. Спостережуваний зв’язок між деполяризацією мітохондрій та активацією АФК може бути фундаментальним явищем у клітинних реакціях, викликаних лазером.
1. Вступ
2. Матеріали та методи
Проектування та характеристика лазерної системи
Характеристика лазерної системи. (А) Експериментальна установка. (Б) Схема лазерної системи. LD - лазерний діод. (C) Розбіжність лазерного променя.
Культура клітин
Клітинну лінію гепатоцелюлярної карциноми людини Huh7, отриману з Японської колекції дослідницьких біоресурсів (JCRB), культивували в середовищі EMEM (American Type Culture Collection, ATCC), доповненій 10% фетальної телячої сироватки (FCS) за рекомендацією постачальника. Культури зберігали у зволоженій 5% атмосфері CO2 при температурі 37 ° C, а середовище міняли двічі на тиждень.
Лазерне лікування
Клітини Huh7 висівали в 35-міліметрові µ-посудини культури IBIDI (IBIDI, Мюнхен, Німеччина) за 24 год до лазерного опромінення. Залежно від експерименту клітини маркували або до лазерного опромінення, або відразу після. Позиціонування оптичних звужувачів у найближчій до клітини зоні проводили за допомогою мікроманіпулятора Еппендорфа (5171, Еппендорф, Весселінг-Берзддорф, Німеччина), який був підключений до мікроскопа Nikon Diaphot 200 (Nikon, Токіо, Японія) (рис. 1 (A )). Оптичні звужувачі стерилізували 75% етанолом до позиціонування в клітинах.
Хімікати
Були використані наступні флуоресцентні зонди: Клітинний АФК/Набір для аналізу супероксиду (Abcam, Кембридж, Великобританія) для виявлення генерації АФК та супероксиду; ацетоксиметиловий ефір кальцеїну (кальцеїн-АМ, 1 мкМ) та гомодимеру етидію (ЕТД-1, 4 мкМ) для контролю життєздатності клітин; JC-1 (2 мкМ) для моніторингу мітохондріального мембранного потенціалу та VAD-FMK, кон'югований з FITC (FITC-VAD-FMK) для виявлення активації каспази-3. Кальцеїн-АМ, етидієвий гомодимер та зонди JC-1 були придбані у компанії Thermo Fisher Scientific. Набір для аналізу клітинних АФК/супероксиду та FITC-VAD-FMK були придбані у Abcam. Щоб спеціально дослідити АФК мітохондрій, клітини завантажували MitoTracker червоний CM-H2XRos (зменшена форма MitoTracker червоний; 0,5 мкМ; Thermo Fisher Scientific), інкубуючи їх протягом 15 хв. Для маркування ядра використовували клітинну проникну флюоресцентну нуклеїнову кислоту SYTO 13 (5 мкМ; Thermo Fisher Scientific). Оптимальний час інкубації для кожного зонда визначали експериментально.
Використовували такі реагенти: циклоспорин А (CsA, 10 мкМ) для інгібування переходу мітохондріальної проникності; некростатин-1 (Nec-1, 10 мкМ) як потужний та селективний інгібітор некроптозу; N-ацетил-L-цистеїн (NAC, 5 мМ) для знешкодження АФК; ставроспорин (STS, 2 мкМ) як відомий індуктор апоптозу; піоціанін (200 мкМ) як відомий індуктор АФК. Некростатин-1, циклоспорин A та N-ацетил-L-цистеїн були придбані у Sigma – Aldrich. Ставроспорин та піоціанін були придбані у Abcam. CellMask Deep Red, придбаний у Thermo Fisher Scientific, використовувався для фарбування плазматичних мембран.
Вимірювання життєздатності клітин
Життєздатність клітин аналізували за допомогою флуоресцентного набору для аналізу живих/мертвих клітин (Thermo Fisher Scientific). Цей двоколірний тест життєздатності флуоресцентних клітин заснований на здатності кальцеїну АМ утримуватися в живих клітинах, індукуючи інтенсивну рівномірну зелену флуоресценцію та EthD-1 для зв’язування ядер пошкоджених клітин, створюючи таким чином яскраво-червону флуоресценцію в мертвих клітинах [29]. Для часового аналізу клітини Huh7 висівали в 35-міліметрові µ-блюда культури IBIDI (IBIDI, Мюнхен, Німеччина) за 24 год до маркування. Клітини фарбували кальцеїном-АМ (1 мкМ) та EthD-1 (4 мкМ) протягом 30 хв. Після маркування клітини піддавали впливу лазерного світла. Згодом зображення були зроблені за допомогою конфокального мікроскопа Bio-Rad MRC-1024 з лазерним скануючим мікроскопом (Bio-Rad, Кембридж, Массачусетс) протягом 50 хв з інтервалом між зображеннями 2 хв. Для обробки зображень було використано програмне забезпечення ImageJ (NIH). Інтенсивність флуоресценції обох барвників вимірювали у відповідні моменти часу і нормалізували до загальної флуоресценції через 30 хв після завантаження барвника. З метою підтвердження достовірності фарбування живих/мертвих також обробляли 10% етанолом протягом 10 хв і подальшої візуалізації (дані не наведені).
Виявлення внутрішньоклітинних активних форм кисню (АФК)
Аналіз апоптозу
Апоптоз оцінювали за допомогою фарбування анексином V/йодом пропідію. Клітини обробляли різними флуенсами опромінення лазером протягом 40 хв. Експресія фосфатидилсерину, як ранній ознака апоптозу, визначалася за допомогою аналізу флуоресцентної мікроскопії шляхом зв'язування міченого флуоресцеїном ізотіоціанату анексину V (Sigma-Aldrich); йодид пропідію (PI) використовували для диференціації некротичних клітин. NucRed використовували як ядерне фарбування (Thermo Fisher Scientific). Зображення флуоресценції реєстрували за допомогою конфокального мікроскопа Bio-Rad MRC-1024, що сканує (Bio-Rad, Cambridge, MA). Програмне забезпечення ImageJ (NIH, Bethesda, MD) було використано для обробки зображень та кількісної оцінки флуоресцентної мікрофотографії. Флуоресценцію PI та анексину V розраховували шляхом нормалізації поправленої загальної флуоресценції клітин (CTCF) повної цікавої області до середньої флуоресценції регіону. Чисту середню інтенсивність CTCF пікселя в області, що цікавить, розраховували для кожного зображення, використовуючи раніше описаний метод [35].