Металлотіоїн запобігає серцево-скорочувальний діабет із високим вмістом жиру, викликаний дієтою

Роль проліфератора пероксисоми - активований рецептор γ-коактиватор 1α та мітохондріальний біогенез

  1. Фен Донг,
  2. Кунь Лі,
  3. Наїр Среджаян,
  4. Дженніфер М. Нанн і
  5. Червень Рен
  1. Від Центру серцево-судинних досліджень та нетрадиційної медицини Університету Вайомінг, Ларамі, Вайомінг
  1. Зверніться до кореспонденції та запитів на передрук до д-ра Джун Рен, Центр серцево-судинних досліджень та нетрадиційної медицини, Університет Вайомінгу, Ларамі, штат Вісконсин 82071. Електронна пошта: jrenuwyo.edu

Роль проліфератора пероксисоми - активований рецептор γ-коактиватор 1α та мітохондріальний біогенез

Анотація

  • EDD, кінцевий діастолічний діаметр
  • ESD, кінцевий систолічний діаметр
  • FFI, інтенсивність флуоресценції фура-2
  • мтДНК, мітохондріальна ДНК
  • mtTFA, фактор транскрипції мітохондрій A
  • NRF, ядерний дихальний фактор
  • PGC-1α, проліфератор пероксисоми, активований рецептором γ-коактиватор-1α
  • АФК, активні форми кисню
  • Sirt, безшумний регулятор інформації
  • TPS, час до пікового вкорочення
  • TR90, час до 90% відновлення

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Дієтичне годування з високим вмістом жиру та внутрішньочеревний тест на толерантність до глюкози.

Описана тут експериментальна процедура була схвалена нашим інституційним комітетом з питань догляду за тваринами. Коротше кажучи, чотиримісячні чоловічі FVB та серцево-специфічні надмірні експресії металотіоїну трансгенні миші вагою ∼20 г були випадковим чином розподілені на дієти з низьким вмістом жиру (10% загальної калорійності) або з високим вмістом жиру (45% загальної калорійності) (Дослідження Дієти, Нью-Брансвік, Нью-Джерсі) протягом 5 місяців. Дієта з високим вмістом жирів була калорійно насиченою (4,83 проти 3,91 ккал/г при дієті з низьким вмістом жиру) завдяки вищому складу жиру. Однак обидві дієти мали подібний поживний склад. Мишей поселяли індивідуально в кліматично контрольованому середовищі з 12-годинним циклом світло/темрява та вільним доступом до дієти та води. Колір хутра був використаний як маркер для ідентифікації металотіонеїну (темно-коричневий) або FVB (білий). Після 5 місяців годування всім мишам голодували протягом 12 год, а потім вводили внутрішньочеревно ін’єкцію глюкози (2 г/кг маси тіла). Зразки крові відбирали з хвоста безпосередньо перед викликом глюкози, а також через 15, 60 та 120 хв. Рівні глюкози в сироватці крові визначали за допомогою аналізатора глюкози Accu-Chek III (15). Систолічний та діастолічний артеріальний тиск досліджували за допомогою напівавтоматизованого посиленого приладу для хвоста. Рівні інсуліну в крові вимірювали за допомогою набору для імуноферментного аналізу інсуліну миші.

діабет

Ехокардіографічна оцінка.

Геометрію та функції серця оцінювали у знеболених (Avertin 2,5%, 10 мкл/г тіла з масою в/в) мишей за допомогою двовимірної керованої М-ехокардіографії (Sonos 5500), оснащеної лінійним перетворювачем 15–6 МГц. Товщину передньої та задньої стінок та діастолічний та систолічний розміри лівого шлуночка реєстрували на знімках у М-режимі, використовуючи метод, прийнятий Американським товариством ехокардіографії. Фракційне вкорочення обчислювали за кінцевим діастолічним діаметром (EDD) та кінцевим систолічним діаметром (ESD), використовуючи таке рівняння: (EDD - ESD)/EDD. Частота серцевих скорочень усереднювалася за 10 серцевих циклів (16).

Виділення кардіоміоцитів.

Після седації кетаміну/ксилазину серця видаляли і перфузували бікарбонатним бікарбонатом (KHB) Кребса-Генселейта (KHB), що містив (у ммоль/л): 118 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO4, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3, 10 HEPES та 11,1 глюкози. Серця перетравлювали колагеназою D протягом 20 хв. Ліві шлуночки були видалені та подрібнені перед фільтруванням. Вихід міоцитів становив ~ 75%, і на нього не впливала дієта з високим вмістом жиру та металотіоїн. Для механічного та внутрішньоклітинного дослідження Ca 2+ були відібрані лише паличкоподібні міоцити з чіткими краями (15).

Вкорочення/подовження клітин.

Механічні властивості кардіоміоцитів оцінювали за допомогою системи м'яких країв IonOptix (IonOptix, Milton, MA). Міоцити поміщали в камеру, встановлену на сцені мікроскопа Olympus IX-70, і суперконфузували (~ 2 мл/хв при 25 ° C) з гідрокарбонатним буфером Кребса-Генселейта, що містить 1 ммоль/л CaCl2. Міоцити стимуляції поля проводили при 0,5 Гц, якщо не зазначено інше. Оцінювали вкорочення та подовження клітин, включаючи пікове вкорочення, що вказує на пікову скоротливість; час до PS (TPS) із зазначенням тривалості скорочення; відновлення часу до 90% (TR90), що вказує на тривалість релаксації; і максимальні швидкості укорочення/відновлення (± dL/dt), що вказує на максимальний розвиток і зниження тиску (15).

Внутрішньоклітинні перехідні процеси Ca 2+.

Когорту міоцитів завантажували фура-2/АМ (0,5 мкмоль/л) протягом 10 хв, і інтенсивність флуоресценції реєстрували за допомогою системи флуоресценції з подвійним збудженням (Ionoptix). Міоцити поміщали на інвертований мікроскоп Olympus IX-70 і знімали через масляну об'єктив Fluor × 40. Клітини піддавали дії світла, випромінюваного лампою потужністю 75 Вт, і пропускали через фільтр 360 або 380 нм, стимулюючи стискатися при 0,5 Гц. Випромінювання флуоресценції було виявлено між 480 і 520 нм, і якісна зміна інтенсивності флуоресценції фура-2 (FFI) визначалась із співвідношення FFI на двох довжинах хвиль (360/380). Час розпаду флуоресценції (одноразовий або двоекспоненційний розпад) розраховували як показник внутрішньоклітинного очищення Ca 2+ (15).

Аналіз виробництва АФК.

Виробництво клітинних АФК оцінювали шляхом аналізу змін інтенсивності флуоресценції, що виникають внаслідок окислення внутрішньоклітинного фторпробувача DCF [5- (6) -хлорметил-2 ', 7'-дихлордигідрофлуоресцеїндіацетат]. Коротше кажучи, кардіоміоцити завантажували 10 мкмоль/л DCF при 37 ° C протягом 30 хв. Міоцити промивали, а потім вимірювали інтенсивність флуоресценції, використовуючи флуоресцентний зчитувач мікропланшетів при довжині хвилі збудження 480 нм і довжині хвилі випромінювання 530 нм. Неліковані клітини не виявляли флуоресценції і використовувались для визначення фонової флуоресценції (17).

Трансмісійна електронна мікроскопія.

Ліві шлуночки фіксували 2,5% глутаральдегідом/1,2% акролеїну у фіксуючому буфері (0,1 моль/л какодилату, 0,1 моль/л сахарози, рН 7,4) та 1% тетроксиду осмію, потім 1% уранілацетату та зневоднювали через градуйовану серію концентрацій етанолу перед введенням у смолу LX112 (LADD Research Industries, Burlington, VT). На ультрамікротомі вирізали надтонкі зрізи (∼50 нм), пофарбували уранілацетатом з подальшим цитратом свинцю та переглянули на трансмісійному електронному мікроскопі Hitachi H-7000, оснащеному цифровим фотоапаратом із зарядженим пристроєм з охолодженням 4K × 4K (18 ). Кількісний аналіз розміру та щільності мітохондрій проводили зі збільшенням × 4000. Для кожного серця миші оцінювали в середньому від шести до семи полів зору.