Межі Оцінка геропротекторних ефектів відібраних флавоноїдів у дрозофіли

Інтегративна та регенеративна фармакологія

Редаговано

Пол Р. Ернсбергер

Школа медицини, Університет Кейс Вестерн Резерв, США

Переглянуто

Медардо Ернандес

Університет Комплутенсе в Мадриді, Іспанія

Хун Чжань

Інститут досліджень Морґріджа, США

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

Завантажити статтю
- Завантажте PDF
- ReadCube
- EPUB
- XML (NLM)
- Додаткові
  Матеріал
Експортне посилання
- EndNote
- Довідковий менеджер
- Простий текстовий файл
- BibTex

ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

1 Кафедра біологічної та медичної фізики Московського фізико-технічного інституту, Долгопрудний, Росія
2 Інститут біології Комі Науковий центр Уральського відділення РАН, Сиктивкар, Росія
3 Кафедра екології, Сиктивкарський державний університет, м. Сиктивкар, Росія
4 Інститут молекулярної біології Енгельгардта РАН, Москва, Росія
5 Insilico Medicine, Inc., Університет Джона Хопкінса, Балтимор, США, США

Вступ

Експерименти, проведені на різних модельних організмах, показали, що можна фармакологічно модифікувати активність пов'язаних з довголіттям сигнальних шляхів. Флавоноїди - це група природних біологічно активних сполук (Zern and Fernandez, 2005; Vauzour et al., 2008; Kumar and Pandey, 2013; Brodowska, 2017). Геропротекторний вплив різних флавоноїдів на модельні організми вивчався в численних дослідженнях, більшість з яких використовують Caenorhabditis elegans як модельний організм для дослідження впливу флаванолів, флавонолів та рослинних екстрактів (Pallauf et al., 2017). Однак цей напрям досліджень не був без суперечок. Експерименти, що стосуються використання однієї сполуки, дали суперечливі або суперечливі результати при проведенні на кількох модельних організмах. Наприклад, було встановлено, що кверцетин збільшує тривалість життя Saccharomyces cerevisiae (Belinha et al., 2007) та C. elegans (Kampkotter et al., 2008; Saul et al., 2008; Pietsch et al., 2009), але не мали впливу на мишей (Jones and Hughes, 1982; Spindler et al., 2013). Ці дослідження підкреслюють важливість відтворюваності геропротекторних ефектів сполуки серед різних модельних організмів, особливо з огляду на те, що пов'язані з довголіттям сигнальні шляхи дуже еволюційно консервативні (Moskalev et al., 2016). Наприклад, збільшення тривалості життя багатьох організмів спостерігалося для протизапального препарату ібупрофену (He et al., 2014) та імунодепресанта рапаміцину (Harrison et al., 2009; Bjedov et al., 2010; Robida-Stubbs et al. ., 2012).

Матеріали і методи

C. elegans Аналіз тривалості життя

C. elegans Аналіз стресостійкості

Експерименти з оцінки стресостійкості проводили на 5-й день лікування флавоноїдами. В експериментах щодо окисного стресу до нематод додавали 100 мМ параквату (метилвіолог, Acros Organics). В експериментах, що випробовували тепловий удар, черв'яків нагрівали до 33 ° С. Кількість загиблих глистів підраховували через 24 год. Для кожного типу стресу експеримент проводили у трьох примірниках. Для кожної експериментальної групи в кожному експерименті було використано 35–117 нематод, загальна кількість у всіх проведених експериментах становила не менше 170 для кожного варіанту. Дані трьох експериментів поєднували. Статистичне порівняння відсотка загиблих тварин для комбінованих даних було проведено за допомогою test-тесту Фішера (Fisher, 1954).

D. melanogaster Аналіз тривалості життя

Дикий тип Canton-S D. melanogaster (Bloomington Stock Center, США) були розділені за статтю і розміщені у флаконах розміром 25 мм × 95 мм (30 мух на флакон) із цукрово-дріжджовим середовищем наступного складу на 1 л: сухі дріжджі - 8 г, агар - 7 г, цукор - 30 г, манна каша - 30 г, пропіонова кислота - 8 крапель (Ashburner, 1989). Для кожної експериментальної групи використовували 100–150 мух. Мух тримали при 25 ° C з 12-годинним циклом світло/темрява. Вихідні розчини ДМСО досліджуваних сполук розчиняли у дріжджовій пасті з кінцевими концентраціями або 0,3, 0,5 та 1 мкМ. Ці концентрації були обрані, оскільки вони вважаються фізіологічними (Kanazawa, 2011). Цю суміш наносили на поверхню живильного середовища, починаючи з першого дня дорослості. Мух перекладали у нові пляшки двічі на тиждень. Кількість загиблих мух підраховували не менше трьох разів на тиждень. Експеримент повторювали тричі. Проводили ті ж статистичні аналізи, що і для глистів.

D. melanogaster Аналіз стресостійкості

Експерименти зі стресостійкості проводили на 10-й день лікування флавоноїдами. Для кожної експериментальної групи використовували 100–150 мух. В експериментах з випробування окисного стресу мух переміщували у флакони з фільтрувальним папером, змоченим у 20 мМ розчині параквату (метилвіологен, Sigma) у 5% сахарозі (0,2 мл на флакон) через 2 години голодування. Мух голодували, перекладаючи у флакони з фільтрувальним папером, насиченим водою замість живильного середовища. В експериментах з приводу стресового стресового стану флакони, що містять мух і живильне середовище, були нагріті до 35 ° C. Кількість загиблих мух підраховували двічі на день. Для кожного типу стресу експеримент проводили у трьох примірниках. Дані трьох експериментів поєднували. Значимість відмінностей між групами для комбінованих даних оцінювали за допомогою test-критерію Фішера (Fisher, 1954).

D. melanogaster Аналіз плодючості

Плодючість самок оцінювали один раз на тиждень, поміщаючи трьох самок та трьох чоловіків того ж віку у флакони зі свіжими поживними речовинами, пофарбованими активованим вугіллям, і даючи 24 години для відкладання яєць. Через 24 години підраховували кількість яєць на самку. Для кожного експериментального варіанту було використано 50 плідних самок. Самців замінювали молодими мухами раз на місяць. Статистичну значимість між кумулятивними кривими оцінювали за допомогою тесту χ 2, використовуючи програму Statistica 6.1 (StatSoft, США) (Fisher, 1954).

D. melanogaster Аналіз спонтанної активності

Для кожного експериментального варіанту було відібрано 30 мух (10 мух на флакон). Чоловіків і жінок аналізували окремо. Мух утримували в стандартних умовах і переносили на нові середовища двічі на тиждень. Стихійну активність тестували протягом 24 годин щотижня за допомогою апаратно-програмного комплексу “Drosophila Population Monitor” (TriKinetics, Inc., США). Статистичний аналіз проводили за допомогою тесту χ 2 із використанням програми Statistica 6.1 (StatSoft, США) (Fisher, 1954).

RT-PCR

У цьому тесті вивчали лише 0,3 та 1,0 мкМ концентрацій вибраних сполук. На 10-й день споживання флавоноїдів мух гомогенізували. РНК екстрагували за допомогою реагенту для лізису QIAzol (Qiagen, Нідерланди) з подальшим осадженням ізопропанолу. РНК очищали за допомогою DNase I, Amplification Grade kit (Life Technologies, Бреда, Нідерланди) відповідно до протоколу виробника. Синтез кДНК проводили за допомогою зворотної транскриптази Revert Aid, як рекомендував Fermentas. ПЛР у реальному часі проводили на ПЛР-системі 7500 в реальному часі (Applied Biosystems, США), використовуючи таку процедуру: (1) денатурація протягом 10 хв при 95 ° C, (2) денатурація протягом 15 с при 95 ° C, (3) відпал протягом 30 с при 60 ° C, (4) подовження протягом 30 с при 60 ° C. Етапи 2–4 повторювали 50 разів.