Модель миші повної травми поперечного пошкодження спинного мозку, зроблена двома операціями - Li - Annals
Чень Лі 1,2,3 #, Сінфей Чжу 1,2 #, Чіа-Мін Лі 3, Чжоруй Ву 1,2, Вапнування Чен 1,2
Внески: (I) Концепція та дизайн: C Li, Z Wu, L Cheng; (II) Адміністративна підтримка: Л Ченг; (III) Надання навчальних матеріалів або пацієнтів: C Li, Z Wu; (IV) Збір та збір даних: CM Lee, X Zhu; (V) Аналіз та інтерпретація даних: Усі автори; (VI) Написання рукописів: Усі автори; (VII) Остаточне затвердження рукопису: Усі автори.
# Ці автори зробили однаковий внесок у цю роботу.
Передумови: Дедалі більше досліджень зосереджуються на лікуванні пошкодження спинного мозку (ІМС) за допомогою тканинної інженерії, але досі не існує ідеальної моделі тварин, яка б справді та об'єктивно змоделювала реальний патологічний процес у клінічній практиці. Крім того, зважаючи на збільшення доступності та використання генетично модифікованих тварин у фундаментальних наукових дослідженнях, стало важливим розробити клінічно пов'язані моделі для ІМС для використання на мишах.
Методи: Сорок вісім мишей C57BL/6 були розділені на три групи (поранені/бутафорські/непоранені). Ми визначили діапазон рубців, спричинений першим пошкодженням, шляхом спостереження зразків, фарбування гематоксиліном та еозином (ВІН) та імунофлуоресцентного фарбування. Трансекція для повного видалення 2-міліметрового сегмента спинного мозку з центром на серцевині ураження була завершена через 6 тижнів після першої травми у поранених груп, тоді як у підробленої групи було проведено повторне оголення спинного мозку без пошкодження трансекції. Характеристики цієї моделі SCI були повністю визначені за допомогою спостереження за зразком, фарбування ВІН, імунофлуоресцентного фарбування та кількісної ланцюгової реакції полімерази в реальному часі (qRT-PCR).
Результати: Жодна миша не загинула після першої травми. Гістопатологічні дані свідчать про те, що діапазон рубців становить 2 мм. Після другої операції 2 миші пораненої групи та 1 миша фіктивної групи загинули. Результати шкали миші Бассо (BMS) та моторно-викликаного потенціалу (MEP) показали, що неврологічна функція мишей не відновилася. Імунофарбування показало, що через 4 тижні після другої травми в ядрі ураження не було нейронів або залишків нейрофіламентів. Астроцити інкапсулювали імунні клітини, утворюючи щільні гліальні рубці. Більшість імунних клітин були приурочені до серцевини ураження і утворювали фіброзні рубці з фібробластами. У той же час спостерігався значний ангіогенез в ядрі ураження та навколо пошкодження. Результати qRT-ПЛР показали, що Ptprc був сильно виражений в ядрі ураження, тоді як Gfap, нестин, Cnp і Sv2b були сильно виражені в сусідній області. Це говорить про те, що ядро ураження є сильно запальною зоною, але поруч із ядром ураження може бути спонтанний нейрогенез.
Висновки: Модель SCI з повним збоєм у роботі з мишею, створена двома операціями, має хорошу імітацію, високу доцільність та високу відтворюваність; це буде корисним інструментом для доклінічного тестування лікування ІМС.
Ключові слова: Травма спинного мозку (ТЗМ); тваринна модель; метод хірургічного втручання; гістопатологія
Подано 09 вересня 2019 р. Прийнято до публікації 02 січня 2020 р.
Вступ
Травма хребта (ІМС) завжди відігравала важливу роль у галузі травматичних захворювань хребта через його високу частоту, високий рівень інвалідності та низький рівень відновлення (1,2). На сьогоднішній день ефективне лікування та реабілітація ІМС залишається складною медичною проблемою у всьому світі (3). За останніми статистичними даними, захворюваність на ІСЗ у світі становить 10,4–83/1 млн. (4). Серйозні наслідки, такі як параліч, спричинений ІСН, часто накладають значні тягарі на сім'ї та суспільство (5). Отже, встановлення стандартної та ідеальної тваринного моделі ІМС є необхідною умовою експериментального вивчення ІМС.
За останні 10 років було досягнуто значного прогресу в лікуванні ІСМ шляхом імплантації стовбурових клітин та функціональних біологічних матеріалів у місця пошкодження, таким чином покращуючи мікросередовище, активуючи ендогенні нервові стовбурові клітини та сприяючи регенерації нейронів та аксонів ( 6-9). Однак більшість із цих методів базуються на гострих моделях тварин на ІСЗ, таких як модель різкого перерізу (10,11), модель пошкодження при стисненні (12), модель пошкодження при роздавленні (13), модель повної пошкодження поперечного перерізу (9) тощо. на. У цих дослідженнях трансплантували клітини або біоматеріали відразу після ІМС, обходячи вплив гліальних рубців та фіброзних рубців на регенерацію нервів. Однак у клінічній роботі через непередбачуваний прогноз, обумовлений обмеженням існуючих діагностичних методик (14), на ранній стадії пошкодження, на якій ще не сформовано лякаючих матеріалів, більшість пацієнтів не погоджуються на хірургічну трансплантацію стовбура клітин, біоматеріалів або інших методів лікування, якщо не поліпшується тривалий параліч. Тому видалення рубцевої тканини має важливе значення для лікування ІМС. Створення відповідної тваринній моделі видалення рубцевої тканини може точно, реалістично та об'єктивно моделювати реальний клінічний процес лікування в клінічній практиці.
Методи
Хірургія на тваринах
Тест на відкритому полі
Для оцінки рухової функції задніх кінцівок мишей використовували тест на відкритих полях шкали миші Бассо (BMS). Подвійним сліпим способом мишей оцінювали один раз на тиждень до і після травми тими самими двома спостерігачами, які не знали про умови експерименту.
Електрофізіологічний аналіз
Електрофізіологічне тестування проводили для кожної групи з використанням двоканального викликаного потенціалу/електроміографії Keypoint II (Dantech) щотижня після першої травми та четвертого тижня після другої травми. Всім тваринам знеболювали внутрішньом’язово (ІМ) ін’єкції кетаміну (20 мг/кг). Моторно-викликаний потенціал (MEP) зазвичай відноситься до потенціалу дії, викликаного стимуляцією рухової кори. Для запису MEP було включено 2 стимулюючі електроди: позитивний електрод поміщали на поверхню черепа моторної області кори головного мозку [передньо-задній (AP) ± 1,0, лівий/правий ± 1,5, дорзо-вентральний (DV) 0, мм від брегми], на 1 мм позаду брегми та 1,5 мм з лівого або правого боку від середньої лінії; а негативний електрод поміщали на череп на 0,5 см поперек позитивного електрода. Записний електрод вводили в лівий або правий черевно-м’язовий м’яз задніх кінцівок на глибині 1,5 мм.