Надання незамінних симбіотичних амінокислот у американського таргана, Periplaneta americana
Пол А. Айей
1 Кафедра еволюції, екології та біології організмів, Університет штату Огайо, США
Томас Ларсен
2 Лабораторія радіометричного датування та дослідження стабільних ізотопів, Крістіан-Альбрехтс-Університет Кіль, Кіль, Німеччина
Закі Сабрі
1 Кафедра еволюції, екології та біології організмів, Університет штату Огайо, США
Пов’язані дані
Про доступність даних була надана наступна інформація:
Вихідні дані подані як додаткова інформація.
Анотація
Вступ
Комахи, які зберігають дієти з обмеженим вмістом основних поживних речовин, можуть покладатися на мутуалістичний симбіоз (облігатний або факультативний) з мікробами для набуття цих поживних речовин і задоволення вимог щодо росту, плодючості, довголіття та, зрештою, придатності (Douglas, 2009) Докази облігатного забезпечення ендосимбіонтами поживними речовинами та їх вплив на придатність хазяїна були продемонстровані в декількох комах-облігатних ендосимбіонтних системах, таких як горохова попелиця-Бухнера (Prosser & Douglas, 1991; Douglas, Minto & Wilkinson, 2001; Russell et al. ., 2014) та мухи цеце-Вігглсвортіа (Pais та ін., 2008). Однак різноманітність мікробних видів та складність міжвидових взаємодій у кишках господарів комах роблять з’ясування внеску та функцій пов’язаної з кишечником мікробіоти складними. Ця складність додатково ускладнюється значними варіаціями складу громади з часом та стадіями розвитку господаря, а також різницею у фізико-хімічних потребах (кисень та рН), необхідних членам громади для виконання певних функцій (Engel & Moran, 2013).
Друга передумова полягає в тому, що бактерії та гриби генерують чіткі δ 13 підписів CEAA (Larsen et al., 2009). Тому можна визначити, чи не дієтичне/симбіотичне введення ЕАА має бактеріальне або грибкове походження. Це здійснюється в рамках прогнозної моделі з використанням мікробних (бактеріальних та грибкових) та дієтичних δ 13 CEAA як класифікаторів для визначення членства в групі таргана δ 13 CEAA. Цей підхід, який називається 13-методом дактилоскопії, був використаний для визначення біосинтетичного походження EAA у декількох системах (Larsen et al., 2009; Larsen et al., 2011; Larsen et al., 2013; Vokhshoori, McCarthy & Larsen, 2014; Ayayee, Jones & Sabree, 2015; Ayayee et al., 2015). Ми висунули гіпотезу, що забезпечення мікробними ЕАА буде більшим у тарганів, які харчуються з низьким вмістом білка, порівняно з тими, хто харчується з високим вмістом білка. Це було б проілюстровано як більші компенсації ізотопів між тарганами, які харчуються дієтою з низьким вмістом білка, та їх дієтою, а також більшою кількістю тарганів, що харчуються з низьким вмістом білків, призначених мікробним (бактеріям або грибкам) класифікаторам у прогнозній моделі.
Методи та матеріали
Джерело комах
Німфи P. americana 5-го ступеня, використані в цьому дослідженні, були отримані з колонії, що містилася в комірництві кафедри еволюції, екології та біології організму в Університеті штату Огайо, Коламбус, штат Огайо. Значні труднощі, пов’язані з упевненим усуненням Blattabacterium з жирових тіл тарганів, зумовили рішення про використання тарганів, інфікованих Blattabacterium, для зручності та доступності. До експериментів комах утримували в ростовій камері (27 ° C та 29% відносної вологості) та годували гранулами для собачих кормів (27% сирого білка).
Дієтичні експерименти
Підготовка зразка
δ 13 Кількісне визначення та аналіз CEAA
Всі зразки гідролізували та дериватизували у розчині метанолу, піридину та метилхлороформату за допомогою одноетапного методу швидкої дериватизації (Walsh, He & Yarnes, 2014; Chen et al., 2010). Потім приблизно 0,35 мкл аликвот дериватизованих зразків вводили в нерозщеплений вкладиш при 250 ° C зі швидкістю потоку гелію 2,8 мл/хв. Умови та оптимізація під час дериватизації та аналізу проводились, як повідомлялося раніше (Chen et al., 2010; Walsh, He & Yarnes, 2014). Аналізи проводили за допомогою газового хроматографа Trace (Thermo Fisher Scientific), з'єднаного з мас-спектрометром коефіцієнта ізотопного співвідношення Delta V Advantage через GC Combustion Interface III (Thermo Electron, Бремен, Німеччина), використовуючи високополярну колонку VF-23ms (Agilent Technologies) . Температура горіння та зниження температури печі становила 950 ° C та 650 ° C відповідно.
δ 13 CEAA, визначений як R зразка EAA ∕ R стандарт EAA - 1 × 1 000 ‰, де R - відношення важкого до легкого ізотопу в EAA зразка, Rsample EAA та стандарту, Rstandard EAA, було визначено для кожного зразок і відкалібрований за міжнародним стандартом δ 13 C, віденська шкала Pee Dee Belemnite (V-PDB) (Coleman & Fry, 1991). Були проаналізовані дві технічні копії на біологічну пробу. Корекцію на додавання вуглецю під час дериватизації проводили після аналізу (Walsh, He & Yarnes, 2014; Chen et al., 2010). Для всіх зразків були отримані чіткі піки без перекриття для ізолейцину, лейцину, валіну, фенілаланіну та лізину ЕАА з капілярної колонки газового хроматографа. Отримані виправлені вуглецем δ 13 значення CEAA лейцину (Leu), ізолейцину (Ile), лізину (Lys), фенілаланіну (Phe) та валіну (Val).
Статистичний аналіз
Змішаний аналіз моделі та середнє відокремлення (t-тест Стьюдента, P = 0,05) проводили для даних LQD та DF δ 13 CEAA за допомогою JMP 10 (SAS Inc., NC, США). Окремі компенсації Δ 13 C між 5 EAA для зразків тарганів та харчових продуктів визначали як: Δ 13 CEAA = δ 13 CCockroEAEAA - δ 13 CDiet EAA. Групи були; неякісна дієта (LQD), придатки плотви, що харчуються LQD, фільтрат кишок плотви, що годується LQD, корм для собак (DF), придатки плотви, що годується DF, і фільтрат кишок плотки, що годується DF.
Ми використали лінійний аналіз дискримінантної функції (LDA), використовуючи δ 13 навчальних даних CEAA з еталонних зразків бактерій та грибів (Larsen et al., 2013), а також дієтичні зразки LQD та DF для створення прогнозної моделі. Дані δ 13 CEAA, отримані від грибка Fusarium solani (n = 2), використані в попередньому дослідженні та проаналізовані на тому ж об'єкті, що і ці зразки, були включені в модель для перевірки (Ayayee et al., 2015). Класифікацію зразків відомих грибів та приналежність до зразків тарганів групи визначали за допомогою пакету R MASS (Venables & Ripley, 2002).
Результати
Δ 13 С-компенсації, виявлені між тарганами, що харчуються LQD та DF, та відповідними дієтами
Визначений суттєвий загальний модельний ефект як для зразків тарганів, що харчуються DF, так і для LQD, та їх відповідних дієт (F (29160) = 110, P 13 CEAA були виявлені серед усіх груп у всіх 5 вимірюваних EAA (F (5,184) = 263, P Таблиця 1). Середнє позитивне Δ 13 Зміщення C для зразків плотви, що годували DF, і зразків фільтрату кишечника, що годували DF, становило відповідно 1,30 ± 0,18 ‰ та 1,4 ± 0,18 ‰ (середнє значення ± se) відносно DF-дієти (0 ‰), тоді як середнє Δ 13 C -зсув між придатками плотви, що харчуються LQD, та зразками фільтрату кишок плотви, що харчуються LQD, становили відповідно 7,8 ± 0,2 ‰ та 4,6 ± 0,2 ‰ (середнє значення ± se), відносно дієти LQD (0 ‰) (таблиця 1). Також були визначені суттєві відмінності в δ 13 CEAA 5 виміряних EAA (F (4,185) = 411, P 13 C-компенсації між зразками тарганів, що харчуються DF та LQD, та їх дієтами для кожного з 5 EAA показано на рис. 1. Як для зразків тарганів, що харчуються DF, так і для LQD, зсуви були найбільшими для лізину та валіну (тобто збагачені 13 С), а потім - лейцину, ізолейцину та фенілаланіну. Загалом, ступінь Δ 13 С -ізотопний зсув був вищим у зразках тарганів, що годувались LQD (6,2 ± 0,2 ‰, середнє значення ± se), порівняно із зразками тарганів, що годувались DF (1,35 ± 0,18 ‰, середнє значення ± se) (рис. 1). Дані CEAA, використані для аналізу, представлені в таблиці S1.