Надмірна вага у мишей та посилений адипогенез in vitro пов’язані з відсутністю їжака

H.-J.L. та S.-B.J. внесли однаковий внесок у цю роботу.

Анотація

Вступ

Поширеність ожиріння та супутніх метаболічних патологій привернула увагу до виявлення етіологічних факторів (1,2). Ожиріння виникає через генетичні, екологічні та поведінкові фактори, що впливають на енергетичний баланс. Основною особливістю ожиріння є надмірне накопичення білої жирової тканини (WAT) (1,3–5). Хоча ожиріння розуміється як централізовано регульований наслідок переїдання та/або зменшення витрат енергії, процеси, що регулюють розширення ВАТ на рівні адипоцитів, недостатньо охарактеризовані.

Розширення ВАТ відбувається за рахунок гіпертрофії адипоцитів та гіперплазії, тому такі процеси, ймовірно, на певному рівні втягують процес адипогенезу (3,4). Адипогенез аналізували за допомогою клітинних ліній преадипоцитів, таких як 3T3-L1, та різних мутантних ліній миші (6). Ці дослідження з'ясували транскрипційну мережу, зосереджену навколо членів сімейства PPARγ та C/EBP, які зумовлюють диференціацію преадипоцитів у адипоцити, що накопичують ліпіди (6). Недавні дослідження виявили клітини стромальної судинної фракції (SVF) WAT, які є добросовісними клітинами-попередниками адипоцитів (7,8). Такі клітини у ВАТ повинні реагувати на гормональні та місцеві сигнали, які регулюють гомеостатичне підтримання цієї тканини. Сигнали, що діють на клітини-попередники адипоцитів, недостатньо зрозумілі, але серед задіяних є сигнальний шлях Їжака (HH).

Білки HH регулюють події розвитку в організмах настільки різноманітно, як комахи та ссавці. Серед білків HH ссавців Sonic Hedgehog (SHH) відіграє найширшу роль і бере участь у зростанні та/або морфогенезі багатьох структур тіла (9). Білки HH активують збережений шлях передачі сигналу (10–12). За відсутності ліганду первинний рецептор HH PTCH1 функціонує, щоб інгібувати передачу сигналів другим мембранним білком, SMO. Зв'язування HH з PTCH1 полегшує інгібування SMO та SMO-сигналів для активації генів-мішеней шляху через фактори транскрипції GLI. Серед таких цільових генів є самі Gli1 та Ptch1, і вони часто використовуються як зчитування активності шляху (10–12).

CDO (також званий CDON), BOC та GAS1 є білками клітинної поверхні, які сприяють активності шляху HH як ліганд-зв'язуючих корецепторів з PTCH1 (13–20). CDO та BOC є спорідненими трансмембранними білками (21,22), тоді як GAS1 - це прикріплений до GPI білок, не пов'язаний з CDO та BOC (23). Аналіз мишей з цільовими мутаціями в Cdon, Boc та Gas1 показав, що, хоча жодна з них не є важливою для активності шляху HH, вони в сукупності необхідні для функціонування шляху в ранньому ембріоні миші (13,14,16,19). Потрійний комплекс ліганду HH, PTCH1 і, принаймні, один з цих корецепторів, здається, необхідний для успішної передачі сигналу (15,16,24). Бок-нульові миші, які були предметом цього дослідження, є життєздатними та родючими, але виявляють дефекти в залежності від SHH нейронного візерунка та наведення аксонів (19,25–28).

Шлях HH негативно регулює адипогенез. Активація шляху HH за допомогою SHH або SMO-агоніста пурморфаміну пригнічувала адипогенез 3T3-L1 та додаткові клітинні лінії (29–32). Крім того, блокада передачі сигналів HH, з домінантно-негативною формою GLI2 або антагоністом SMO циклопаміном, посилювала адипогенез цих клітин у відповідь на індукуючі фактори (31,32). Сигнали HH блокували ранні етапи адипогенезу, вище за течією експресії PPARγ (29,31,32). Ці дослідження показують, що шлях HH функціонує для блокування диференціації преадипоцитів in vitro. Експерименти на мишах узгоджуються з цим поняттям. Дорослі миші, гомозиготні за гіпоморфним алелем Ptch1, продемонстрували знижену масу ВАТ, яка мала нижчий рівень жирових маркерів та підвищений рівень цільових генів HH (33). Мутація, характерна для жирової тканини, іншого інгібітора шляху HH, Суфу, призвела до втрати ВАТ (34). Нарешті, миші з індукованим дієтою або генетичним (ob/ob) ожирінням демонстрували знижену експресію компонентів шляху HH (31).

Незважаючи на те, що миші з генетичним коефіцієнтом посилення функції в активності шляху HH продемонстрували втрату WAT (33,34), не було продемонстровано, що миші з втратою активності HH посилювали ожиріння. Ми повідомляємо, що миші з мутацією зародкової лінії у Boc демонструють залежність від віку надмірної ваги через збільшення WAT. Ці миші також виявляють завищену реакцію на дієту з високим вмістом жиру (HFD), а Boc -/- фібробласти ембріонів диференціюються в адипоцити ефективніше, ніж клітини дикого типу. Ці результати показують, що BOC, який, мабуть, діє як корецептор SHH, необхідний для підтримки нормальної ваги in vivo та належного регулювання адипогенної диференціації in vitro.

Дизайн та методи дослідження

Для оцінки метаболічних параметрів (рис. 2) 5-місячних мишей Boc +/+ та Boc -/- аналізували за допомогою метаболічних клітин (Гарвардський апарат; Panlab). Вимірювання проводили протягом 48 год, протягом яких тварини мали доступ до їжі та води. Температуру тіла в основному вимірювали за допомогою гомеотермічного ковдри/прокладки HB-101 (Гарвардський апарат).

Гістологія, фарбування маслом червоного кольору O та фарбування плацентарної лужної фосфатази

Для фарбування гематоксилін-еозином (H-E) WAT і тканини печінки фіксували та обробляли для парафінових зрізів 20 мкм. Для фарбування Oil Red O печінки фіксували у 4% PFA та зневоднювали градієнтом сахарози з подальшим оптимальним різанням сполуки - кріосекція (10 мкм) та фарбуванням Oil Red O. Для фарбування олійно-червоним O диференційованих мишачих ембріональних фібробластів (MEF) та клітин 3T3-L1 культури фіксували у 10% формальдегіді протягом 10 хв і фарбували олійним червоним O. Пофарбовані пластинки обробляли 1 мл ізопропанолу/4% NP-40 протягом 10 хв легким струшуванням, і екстрагований Олійно-червоний О визначали кількісно, вимірюючи оптичну щільність при 520 нм. Для фарбування плацентарної лужної фосфатази (PLAP) тканини фіксували 2% PFA плюс 0,2% глутаральдегіду протягом 2 год при 4 ° C, промивали PBS, проникали в 0,3% Triton протягом ночі при 4 ° C, промивали сольовим розчином, інактивували тепло 30 хв при 72 ° С, промивають NTM (100 ммоль/л NaCl, 100 ммоль/л трис-HCl, рН 9,5, 50 ммоль/л MgCl2), і фарбують BM фіолетовим (Roche).

Клітинні культури

Підготовка SVF з WAT проводилася, як описано раніше (8). Коротше кажучи, WAT подрібнювали ножицями і розщеплювали 2 мг/мл колагенази I (Sigma-Aldrich) в DMEM при 37 ° C протягом 1 години. DMEM плюс 10% FBS додавали для подвоєння обсягу, плаваючі адипоцити видаляли і дайджест фільтрували через 100-мкм сітку, яка утримувала судини фракції стромальних частинок. Фільтрат центрифугували при 800g протягом 5 хв, а гранулу SVF ресуспендували в DMEM, що містить 10% FBS, і культивували протягом 2 днів.

Виділення первинних MEF проводили, як описано раніше (35). Клітини 3T3-L1 та MEF культивували в середовищі для зростання (DMEM плюс 10% FBS) при субконфлюенции. Для диференціації адипоцитів клітини вирощували до місця злиття і переводили в середовище диференціювання I (середовище росту плюс 0,5 мкмоль/л IBMX, 1 мкг/мкл інсуліну, 0,25 мкмоль/л дексаметазону, 2 мкмоль/л розиглітазону; Sigma-Aldrich) протягом 2 днів . Потім живильне середовище змінювали на середовище диференціювання II (середовище росту плюс 2 мкмоль/л розиглітазону), а середовище змінювали кожні 2 дні. Щоб активувати передачу сигналів SHH, MEF обробляли 250 нг/мл SHH (R&D Systems) або 5,2 мкмоль/л пурморфаміну (Calbiochem) у середовищі для диференціації з дня диференціації на наступний день.