Низькому індексу маси тіла при ендометріозі сприяє метаболічна дисфункція печінки у мишей
Лора Г. Гетц
Кафедра акушерства, гінекології та репродуктивних наук, Єльська медична школа, Нью-Хейвен, штат Коннектикут
Раманая Маміллапаллі
Кафедра акушерства, гінекології та репродуктивних наук, Єльська медична школа, Нью-Хейвен, штат Коннектикут
Х'ю С. Тейлор
Кафедра акушерства, гінекології та репродуктивних наук, Єльська школа медицини, Нью-Хейвен, штат Коннектикут
Анотація
ВСТУП
Ендометріоз є одним із найпоширеніших гінекологічних розладів серед жінок репродуктивного віку [1]. Характеризується відкладенням і розмноженням клітин або тканин ендометрія поза порожниною матки [2, 3]. Основним симптомом ендометріозу є тазовий біль, який вражає 50% пацієнтів [4], а потім безпліддя, про яке повідомляється у 40% –50% пацієнтів [5]. Ці симптоми можуть серйозно вплинути на якість життя жінки [6]. ]. Ендометріоз є різноманітним та складним розладом, і пацієнти часто повідомляють про дифузні симптоми, не пов’язані з розмноженням, і точна причина та патофізіологія досі недостатньо вивчені [1, 7]. Жінки із цим захворюванням часто скаржаться на втрату ваги, алергію, втому, запалення та порушення функції кишечника.
Причина цих незрозумілих раніше симптомів невідома, але може бути наслідком порушення регуляції множинних молекулярних шляхів у кількох системах органів поза репродуктивним трактом. Існування нижчого індексу маси тіла (ІМТ) серед жінок з ендометріозом порівняно з тими, хто не має захворювання, добре встановлено [8–15]. Жодні попередні дослідження не досліджували наслідки ендометріозу на печінку. В даний час невідомо, чи спостерігається фенотип низького ІМТ у жінок з ендометріозом безпосередньо пов’язаний із захворюванням і, якщо так, то за яким механізмом. Тут ми намагалися визначити, чи може ендометріоз спричинити порушення метаболічної регуляції.
Печінка є головним пунктом метаболічної регуляції та центральним посередником для підтримки енергетичного гомеостазу [4, 16–19]. Встановлено, що експресія генів печінки порушена у жінок із ожирінням [20–22]. Ендометріоз створює змінене запальне середовище [23–25], яке може змінити експресію генів у віддалених органах. Дійсно, ми раніше демонстрували, що ендометріоз впливає на експресію генів матки [26], припускаючи, що ендометріоз може призвести до зміненої експресії генів і в нерепродуктивних органах. Про зміни експресії генів печінки внаслідок ендометріозу поки не повідомляється; однак було показано, що порушення регуляції гена печінки змінює ІМТ на мишачій моделі [27], а ожиріння клінічно асоціюється із зміненою експресією генів у печінці [28, 29]. Це робить печінку цікавим кандидатом для участі в можливому метаболічному компоненті ендометріозу.
Тут ми порівняли масу тіла, склад тіла та експресію печінкових генів у мишей з індукованим хірургічним шляхом ендометріозом з такими контрольними мишами, які перенесли фіктивну операцію. Ми виявили порушення метаболізму, спричинені ендометріозом, пов’язані зі зниженням маси тіла та жиру. Ці результати можуть пояснити клінічно спостережувану низьку масу тіла жінок з ендометріозом.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Усі експерименти на тваринах проводились згідно з погодженням з протоколом Комітету з догляду за тваринами Єльського університету із загальним використанням 30 мишей. Ендометріоз був індукований у 12-тижневих самок мишей C57BL/6 (n = 6) шляхом зашивання двох відділів матки, кожен з яких складається з половини маточного рога від донора, у порожнину очеревини згідно з раніше повідомленими методиками [30, 31 ]. На контрольних мишах (n = 6) проводили фіктивні операції. Їжа споживалась за бажанням усіма тваринами, і обидві групи отримували однаковий чау. Мишей зважували щотижня у переносних вагах (Uline), і масу тіла реєстрували з точністю до 0,1 грама, починаючи через 1 тиждень після індукційної операції. Двоенергетичну рентгенівську абсорбціометрію (DEXA; GE Medical Systems) проводили через 7 тижнів після операції. В іншому наборі 9-тижневих самок мишей C57BL/6 ендометріоз індукували відповідно до тих самих хірургічних процедур (n = 9 у кожній групі). Цей набір мишей був евтаназований дислокацією шийки матки після задушення СО2 через 21 тиждень, а печінку збирали та зберігали в РНКлатер (Qiagen) при −80 ° C для виділення РНК та білка. Наявність стійких уражень ендометріозу підтвердили під час розтину.
Виділення РНК
Тканину печінки (100 мг) гомогенізували в 1 мл реагенту TRIzol (Invitrogen). Гомогенати витримували на льоду протягом 5 хв, а потім до кожного додавали 0,2 мл хлороформу, і зразки вихровували протягом 15 с, інкубували при кімнатній температурі 3 хв і центрифугували при 12000 об/хв при 4 ° С протягом 15 хв. Потім водний шар переносили в свіжу пробірку, і РНК осаджували додаванням 0,5 мл ізопропілового спирту, інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хв і центрифугували при 10000 об/хв протягом 15 хв; потім гранули РНК збирали, промивали 75% етанолом і розчиняли у воді без РНКази. Загальну РНК очищали за допомогою набору для очищення RNeasy (Qiagen) і кількісно визначали спектрофотометром NanoDrop. Очищену РНК негайно використовували для синтезу кДНК, а потім піддавали аналізу мікрочипів або зберігали при -80 ° C до використання пізніше.
Миша мікрогенезу миші
Високоякісну загальну РНК (250 нг) піддавали набору реагентів WT PLUS (Affymetrix), дотримуючись інструкцій виробника. Коротко, загальна РНК була ампліфікована для створення кДНК, яка використовувалася для транскрипції in vitro для створення комплементарної РНК (кРНК). КРНК очищали за допомогою очищення гранул і визначали кількісно. КРНК (15 мкг) використовували із випадковим праймером, щоб генерувати другий цикл кДНК сенсу напрямку першого ланцюга. КДНК очищали методом очищення гранул і визначали кількісно. Потім одноцепочечну кДНК (sscDNA; 5,5 мкг) ферментували за допомогою ADP та UDG, використовуючи термінальний набір для маркування (Affymetrix) і запускали на біоаналізаторі (Agilent) для забезпечення належного розміру транскрипту. Потім фрагментований матеріал маркували за допомогою термінальної дезоксинуклеотидилтрансферази, поміщали в коктейль для гібридизації та гібридизували за допомогою маси мишей GeneChip 2.0 ST протягом ночі при 45 ° C. Масиви промивали та фарбували за допомогою текучої станції моделі 450, а потім сканували за допомогою сканера моделі 3000 7G (обидва Affymetrix). Програмне забезпечення консолі виразу Affymetrix було використано для створення вихідних та нормалізованих даних для подальшого аналізу. MATLAB (MathWorks) був використаний для аналізу вихідних даних.