Остеосклероз внаслідок посилення функції Notch залежить лише від Rbpj
Цзяньнін Тао
1 Кафедра молекулярної та людської генетики, Медичний коледж Бейлора, Х'юстон, Техас, США
Шань Чень
1 Кафедра молекулярної та людської генетики, Медичний коледж Бейлора, Х'юстон, Техас, США
Дао Ян
1 Кафедра молекулярної та людської генетики, Медичний коледж Бейлора, Х'юстон, Техас, США
Брайан Доусон
1 Кафедра молекулярної та людської генетики, Медичний коледж Бейлора, Х'юстон, Техас, США
Ельда Мунівес
1 Кафедра молекулярної та людської генетики, Медичний коледж Бейлора, Х'юстон, Техас, США
Террі Бертін
1 Кафедра молекулярної та людської генетики, Медичний коледж Бейлора, Х'юстон, Техас, США
Брендан Лі
1 Кафедра молекулярної та людської генетики, Медичний коледж Бейлора, Х'юстон, Техас, США
2 Медичний інститут Говарда Х'юза, Медичний коледж Бейлора, Х'юстон, Техас, США
Анотація
Вступ
Фізіологічне ремоделювання кісток - це процес, що визначається балансом між утворенням кісток остеобластами та резорбцією кісток остеокластами. Дисбаланс у реконструкції кісток сприяє декільком патологічним станам, включаючи остеосклероз, остеопетроз та остеопороз. За оцінками, ці умови впливають на десятки мільйонів людей. Остеосклероз - це порушення кісткової тканини, яке характеризується аномальним потовщенням та прогресивним збільшенням кісткової маси скелета внаслідок збільшення кількості остеобластів.1 На відміну від цього, остеопетроз виникає внаслідок первинного зниження остеокластичної функції.2 В даний час зовнішні причинні фактори (наприклад, повідомлено про причинні генетичні фактори або сигнальні шляхи, які беруть участь в остеосклерозі. 7, 8, 9, 10
З початку цього десятиліття дотепер генетичні дослідження людини виявили мутації багатьох компонентів сигнального шляху Notch, що спричиняють дефекти скелета.14 Наприклад, мутації гена DLL3, а згодом у генах MESP2 та LFNG були виявлені, щоб викликати спондилокостальний дизостоз (SCDO), спадковий розлад, що характеризується аномальним утворенням хребців та візерунком. Одночасно дослідження відповідних моделей мутантних мишей розширили наше розуміння цих вроджених вад розвитку. Крім того, аномальна сигналізація Notch відіграє важливу роль у патогенезі лейкемії та ряду інших видів раку.16 Інтенсивні дослідження виявили нові активуючі мутації в Рецептор Notch1, який відповідає за понад 50% зразків гострого лімфобластного лейкозу (T-ALL) людини T7. Важливо, що наші та інші дослідження свідчать про те, що активація передачі сигналів Notch сприяє патогенезу остеосаркоми людини. 18, 19, 20
Матеріали і методи
Тварини
Умовні миші-нокаути Rbpj flox/flox, Col1a1 2,3 ‐ kb трансгенні миші Cre (TG Col1a12,3kbCre/+) та трансгенні миші Rosa Notch (TG NICDflox/+) були описані раніше. 25, 26, 27 гібридний 129 × C57BL/6 фон. Генотипування ПЛР проводили, як описано. Тварин використовували відповідно до Керівництва Національного інституту охорони здоров’я щодо догляду та використання лабораторних тварин. Усі миші були розміщені в конкретному приміщенні, вільному від патогенів, і в умовах, контрольованих світлом, температурою та вологістю. Ці дослідження були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин у Медичному коледжі Бейлора.
Підготовка скелета та гістологія
Скелетні препарати цілого монтажу, забарвлені альціановим синім 8GX (Sigma Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) та азариновим червоним S (Sigma Aldrich), були приготовані, як описано раніше. f мишей евтаназували у віці від 3 до 8 тижнів, а цілі скелети фіксували протягом доби у 10% нейтральному забуференному формаліні. Ми розділили вкладені в парафін декальциновані кістки на товщину 6 мкм і забарвили ділянку гематоксиліном та еозином (H&E), толуїдиновим синім та плямами Гольднера за стандартними протоколами. Скелетні препарати кінцівок були сфотографовані за допомогою 5,0-мегапіксельної цифрової камери Nikon, встановленої на розсікаючому прицілі Nikon SMZ1500. Усі настройки мікроскопа та камери були однаковими для зйомки всіх зображень. Файли цифрових зображень були завантажені в програмне забезпечення Axiovision (Carl Zeiss Vision, Мюнхен-Холбергмус, Німеччина), підключене до зони дії Zeiss Axioplan 2, і еквівалентність масштабу була досягнута шляхом передачі інформації про калібрування сценічного мікрометра. Ці процедури дозволяли безпосередньо порівнювати кожне зображення.
Вимірювання кісткової мікро-комп’ютерної томографії (µCT)
Ми проаналізували трабекулярну кістку дистального відділу стегнової кістки за допомогою системи µCT (µCT ‐ 40, Scanco Medical, Бассердорф, Швейцарія), використовуючи стандартний протокол з ядра µCT в Медичному коледжі Бейлора. Коротко кажучи, стегнові кістки 8-тижневих мишей були розкриті, очищені від м'яких тканин і зафіксовані на 2 дні в 10% нейтральному забуференному формаліні, а потім зберігалися в 70% етанолі при 4 ° C. Трабекулярну кістку аналізували на дистальному кінці стегнової кістки, починаючи з кінця пластини росту. У середній спонгіозі з високою роздільною здатністю оцінювали сімдесят п’ять зрізів загальною довжиною 1,20 мм. Для тривимірної оцінки було використано порогове значення 210.