P38SJ, новий білок DINGG, захищає клітини нейронів від травм та смерті, спричинених алкоголем

Шоре Аміні

1 Кафедра нейронауки, Центр нейровірусології, Медична школа Темплського університету, Філадельфія, Пенсільванія

2 Департамент біології, Коледж науки і техніки, Університет Темпла, Філадельфія, Пенсільванія

Нана Мерабова

Камель Халілі

Нуне Дарбініан

1 кафедра нейронауки, Центр нейровірусології, Медична школа Темплського університету, Філадельфія, Пенсільванія

Анотація

Етанол індукує пошкодження нейрональних клітин та смерть шляхом порушення регуляції кількох сигнальних подій, які частково контролюються активацією MAPK/ERK1/2 та/або інактивацією відповідної фосфатази, PP1. Нещодавно ми очистили новий білок розміром 38 кДа, p38SJ, від культури калюсу Hypericum perforatum, яка належить до нового сімейства білків DINGG з фосфатно-зв'язуючою активністю. Тут ми показуємо, що обробка нейрональних клітин p38SJ захищає клітини від пошкоджень, спричинених впливом етанолу. Крім того, попередня обробка нейрональних клітин p38SJ знижує рівень проапоптотичного білка Bax та деякі події, пов'язані з апоптозом, такі як розщеплення каспази 3. Крім того, викликаючи стрес, алкоголь може підвищити вироблення активних форм кисню (АФК), що призводить до зменшення активності супероксиддисмутази (СОД). Наші результати показали, що p38SJ відновлює активність СОД у нейрональних клітинах, оброблених етанолом. Ці спостереження забезпечують новий біологічний інструмент для розробки нових підходів для запобігання загибелі нейрональних клітин, спричинених етанолом, і, можливо, лікування неврологічних розладів, пов'язаних із зловживанням алкоголем.

ВСТУП

Зловживання алкоголем пов'язане з численними неврологічними та поведінковими дефіцитами, включаючи нейропатію та енцефалопатію, дегенерацію мозочка, когнітивні зміни та порушення судження та пам'яті (огляд див. Alderazi and Brett 2007; Brun and Andersson 2001; Brust 2008; Johnson et al., 1986 ). Етанол пошкоджує нервову систему та спричинює пошкодження нейрональних клітин, впливаючи на кілька шляхів передачі сигналу, включаючи MAPK (Sanna et al, 2002, Logrip 2008). Активація MAPK етанолом залежить від рецепторів. Серед рецепторів, на які впливає етанол, є рецептори ГАМК (Lee et al, 2007a, Ueno 2001). Було показано, що клітинні ефекти етанолу, що виникають за допомогою модуляції транскрипційних шляхів PKA та CREB, активуються через рецептори GABA (Criswell and Breese, 2005); підвищена експресія PKA та CREB спостерігалася після обробки етанолом (Pandey et al., 2001).

Більш ранні дослідження показали, що етанол може спричинити загибель нейрональних клітин через окислювальний стрес (Antonio et al., 2008; Haorah et al., 2008a; Heaton et al., 2002, 2003; Lee et al., 2007; Ramachandran et al., 2003; Watts et al., 2005). Недавні дослідження також показали підвищення рівня АФК у ЦНС алкоголіків, ймовірно, через метаболізм етанолу (Haorah et al., 2008a). Індукований алкоголем окислювальний стрес у мозку широко вивчався як новий шлях нейродегенерації, пов'язаний із зловживанням алкоголем (Haorah et al., 2008a та b). Багато добре розроблених досліджень вказують на важливість активації кіназ та інгібування фосфатаз при пошкодженні клітин, спричиненому індукованим етанолом окислювальним стресом у мозку (Haorah et al., 2005, 2007, 2008b; Lohmann 2004). Потенційні механізми, що ведуть до індукції окисного стресу та алкогольної індукції АФК, і, отже, до пошкодження нейронів, не повністю вивчені.

Нещодавно ми ідентифікували новий білок 38 кДа, p38SJ, із культури культивування калюсу Hypericum perforatum in vitro та клонували його часткову кДНК, p27SJ. p27SJ належить до сімейства білків DINGG, оскільки містить збережену послідовність DINGG на N-кінці (Darbinian et al., 2008; Perera et al., 2008). p27SJ проявляє здатність модулювати експресію вірусних і клітинних генів, включаючи ВІЛ-1, MCP-1 (Darbinian-Sarkissian et al., 2006; Mukerjee et al., 2008),

У людини пептид, що містить DINGG, був вперше виявлений у синовіальній рідині і виявлено, що він є частиною більш великого білка, відомого як стимулюючий білок синовіальних Т-клітин р205 (Blass et al, 1999; Hain et al, 1996). Подальші дослідження призвели до ідентифікації іншого члена сімейства DINGG людини з ефектами, що стимулюють ріст у нормальних та пухлинних клітинах (Adams et al, 2002; Belenky et al, 2003; Morales et al, 2006). На додаток до людської тканини, білки DINGG були виділені з різних грибів, тканин тварин і рослин і виявляють тісну гомологію з білками Pseudomonas (огляд див. Ahn et al, 2007; Berna et al, 2002, 2008; Chen et al, 2007; Lewis and Crowther, 2005; Moniot et al, 2007; Pantazaki et al, 2007; Riah et al, 2000; Scott and Wu, 2005).

Тут ми демонструємо, що лікування нейрональних клітин p38SJ захищає їх від апоптозу, викликаного етанолом.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Культура клітин

Кортові нейрони щурів розмножували після ферментативної та механічної обробки ембріональної тканини щурів Sprague Dawley на 17 день (E17) з використанням ферменту TrypleExpress (Invitrogen, Carlsbad, CA) при 37 ° C протягом 10 хв, після чого проводили три промивання середовищем Hibernate E. Після механічної обробки тканини полірованою вогнем скляною піпеткою Пастера суспензію одноклітин розбавляли живильним середовищем і клітини висівали на 60-міліметровий посуд з покриттям полі-D-лізину щільністю 2,5 × 10 6/пластину і культивували в 3 мл нейробазального середовища, що містить добавку B27, 0,25 мМ глутамаксу та 0,25 мМ L-глутаміну (все від Invitrogen). Клітини підтримували при 37 ° С у зволоженому інкубаторі, що містив 7% СО2.

Мікроскопія

Фазово-контрастні зображення нейрональних клітин візуалізували за допомогою інвертованого флуоресцентного мікроскопа Olympus за допомогою програмного забезпечення IPLAB. Контраст і яскравість регулювались однаково для всіх зображень за допомогою Adobe Photoshop версії 5.5.

Препарат рослинного екстракту

Сто міліграм висушеної H. perforatum розчиняли в 1 мл буфера для лізису, що містив 30 мМ Трис (рН 7,4), 167 мМ NaCl, 0,1% Нонідет Р-40 та коктейль інгібіторів протеази (Sigma, Сент-Луїс, Міссурі, США). Клітинний сміття видаляли центрифугуванням при 14000 об/хв протягом 5 хв при 4 ° С. Загальні розчинні білки з калюсу центрифугували при 10000 об/хв протягом 5 хв, і супернатант відновлювали і фракціонували через фільтри MilliPore Microcon 3, 30 і 50 кДа (Millipore, Billerica, MA, США), щоб відокремити білок 38 кДа від низькомолекулярного ваги білків та інших рослинних органічних компонентів. Чистоту білка 38 кДа визначали за допомогою SDS-PAGE.