Пептидне гідрування та інкапсуляція клітин для тривимірної культури клітин раку молочної залози MCF-7

Співпрацювали в цій роботі з: Хончжоу Хуан, Ін Дін

Афілійований відділ зернової науки та промисловості, Університет штату Канзас, Манхеттен, штат Канзас, Сполучені Штати Америки

Співпрацювали з цією роботою з: Хончжоу Хуан, Ін Дін

Афілійований відділ біохімії Канзаського державного університету, Манхеттен, штат Канзас, Сполучені Штати Америки

Афілійований відділ діагностичної медицини/патобіології, Університет штату Канзас, Манхеттен, штат Канзас, Сполучені Штати Америки

Хунчжоу Хуан,
Ін Дін,
Сюжи С. Сонце,
Чт А. Нгуєн

Цифри

Анотація

Цитування: Huang H, Ding Y, Sun XS, Nguyen TA (2013) Пептидне гідрування та інкапсуляція клітин для тривимірної культури клітин раку молочної залози MCF-7. PLoS ONE 8 (3): e59482. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0059482

Редактор: Адам Дж. Енглер, Каліфорнійський університет, Сан-Дієго, Сполучені Штати Америки

Отримано: 17 вересня 2012 р .; Прийнято: 14 лютого 2013 р .; Опубліковано: 20 квітня 2013 р

Фінансування: Цей проект був частково профінансований Програмою цільової досконалості KSU та Стипендіальною програмою KSU, а також внеском (№ 12-181-J) від Канзаської сільськогосподарської експериментальної станції. Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Двовимірні (2D) субстрати, такі як полістирол культури тканин та поверхня тканинних аналогів, вносять величезний внесок у сучасні дослідження клітин in vitro; однак традиційні 2D-платформи не можуть точно імітувати складну 3D-архітектуру позаклітинного матриксу (ECM), де перебувають природні клітини [1] - [4]. У 2D-культурі одношарові клітини відчувають однорідну концентрацію поживних речовин та факторів росту, які індукують неприродне середовище клітин та взаємодії клітин-клітин, даючи плоску та розтягнуту морфологію [5]. Недавні дослідження показали, що морфологічні відмінності клітин, культивованих у 2D та 3D, можуть демонструвати кілька разючих відмінностей у тонких клітинних процесах, таких як проліферація, апоптоз, диференціація, експресія генів, міграція та чутливість до наркотиків [6] - [9]. З іншого боку, біологічні 3D-системи in vivo, такі як тваринні моделі, є дорогими та трудомісткими. Тому необхідні вдосконалені системи 3D-моделей in vitro, щоб заповнити пробіл між неточними 2D-системами та моделями тварин, імітуючи складність ECM та фізіологічну значимість біологічної системи in vivo.

У цьому дослідженні розчин нещодавно ідентифікованого пептиду, званий h9e, готували при нейтральному pH і змішували з мінімальним ефірним середовищем (MEM, з 10% FBS) при кімнатній температурі. Після змішування пептиди h9e самостійно збираються в гідрогелеву матрицю з кінцевою концентрацією пептиду до 1 мМ (0,17%). Без введення будь-якого додаткового гелеутворювального буфера або регулювання рН середовища або температури, пептид забезпечує зручний і м’який процес утворення гідрогелю і дозволяє оточувати клітини своїм культуральним середовищем під час інкапсуляції клітин (таблиця S1). Що ще цікавіше, механічна міцність цієї гідрогелевої матриці демонструє особливу здатність до деформації та повторного збирання, що дозволяє гелерозчинній трансформації шляхом багаторазового піпетування. Клітинна лінія раку молочної залози MCF-7 була обрана як модель для вирощування в 3D культурі гідрогелів h9e-MEM. Дослідження морфології клітин, життєздатності та проліферації показали, що клітини виявляли 3D-цитоархітектуру в гідрогелевій матриці та зберігали високу біоактивність для подальших досліджень після виділення. Цисплатин, протираковий препарат, використовували для вивчення його ефективності на клітинах MCF-7 у матриці гідрогелю. Загалом, результати показують сильну підтримку того, що пептид h9e є перспективним 3D-матеріалом культури клітин для тестування на наркотики.

Матеріали і методи

Матеріали

N, N-диметилформамід (DMF), трифтороцтова кислота (TFA), піперидин, N, N-диізопропілетиламін (DIEA), триізопропілсилан (TIS), параформальдегід, глутаральдегід, цис-Діаміндіхлор-платина, 0,4% трипановий блакитний інсулін, 0,4% трипановий синій інсулін, -актинові антитіла були придбані у Sigma-Aldrich (Мілуокі, Вісконсин). N-метилпірролідінон (NMP), безводний ефір, дихлорметан (DCM) та бікарбонат натрію були придбані у Fisher Scientific (Пітсбург, Пенсільванія). Rink Amide MBHA Смола, 2- (1H-бензотріазол-1-іл) -1,1,3,3-тетраметилуроній гексафторфосфат (HBTU) та всі захищені амінокислоти були придбані у EMD Biosciences (Сан-Дієго, Каліфорнія). N-гідроксибензотріазол (HOBT) був придбаний у CEM (Matthews, NC). Піруват натрію, незамінні амінокислоти, MEM із солями Орла, розчин трипсину TrypLE Express, 4 ′, 6-діамідино-2-феніліндол (DAPI) та флуоресцентний барвник Hoechst 33342 (10 мг/мл) придбані у Invitrogen (Carlsbad, Каліфорнія). Фетальна бичача сироватка (FBS) була придбана у Atlanta Biologicals (Лоуренсвілль, Каліфорнія). Анти-сурвівін, анти-Ki67 та анти-каспаза-3 антитіла були отримані від Santa Cruz Biotechnologies (Санта-Крус, Каліфорнія). Антирозщеплені каспазу-3 та зв’язані з HRP антитіла проти кролика/миші були придбані у Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Культура клітин

Клітинна лінія раку молочної залози людини MCF-7 була придбана у American Type Cell Culture (ATCC) (Манассас, Массачусетс). Клітини вирощували в середовищі MEM з 10% (об/об) FBS, 1 мМ пірувату натрію, 17,9 мМ бікарбонату натрію, 0,01 мг/мл інсуліну та 1% (об/об) несуттєвої амінокислоти. Клітини витримували в колбах культури тканин Т-75 см 2 (Greiner Bio-one, Begium) при 37 ° C з 5% (об/об) CO2. Клітини регулярно пропускали трипсином, а середовище змінювали через день.

Синтез і гідрогеляція пептидів

Пептид h9e синтезували згідно з раніше опублікованим протоколом [36]. Коротко кажучи, пептиди були синтезовані на автоматизованому синтезаторі мікрохвильових пептидів CEM Liberty (CEM Corporation, Matthews, NC) відповідно до нестабільної 9-флуоренілметоксикарбонільної (Fmoc) стратегії з амідною смолою Rink та захищеними Fmoc амінокислотами. Після остаточного зняття захисту з N-кінцевої групи Fmoc зв’язані зі смолою пептиди зняли з бічного ланцюга та розщепили, використовуючи TFA/TIS/воду (95/2,5/2,5 об./Об.). Пептиди осаджували і тричі промивали безводним ефіром, розчиняли в ацетонітрилі та деіонізованій воді (50/50 об./Об.), Потім сушили ліофілізацією. Молекулярна маса та чистота синтезованих пептидів були підтверджені за допомогою матричної лазерної десорбції/іонізації за часом масової спектроскопії та високоефективної рідинної хроматографії.

Ліофілізований пептид додавали до 100 мМ бікарбонату натрію і повністю розчиняли при магнітному перемішуванні протягом 3 годин з кінцевою концентрацією пептиду 10 мМ. Для гідрогеляції розчин пептиду додавали в MEM з 10% FBS і суміш струшували вручну протягом 10 секунд. Пептидний гідрогель утворюється протягом 15 хвилин при кімнатній температурі з кінцевою концентрацією пептиду 1, 2 та 3 мМ.