Періодичне введення дієти, позбавленої лейцину, здатне втручатися у діабет 2 типу у Росії
Пов’язані дані
Анотація
1. Вступ
Лейцин, одна з незамінних амінокислот, належить до сімейства амінокислот з розгалуженим ланцюгом (BCAA). Проведено численні інтервенційні дослідження, які показали, що підвищення рівня ВСАА з дієтою, включаючи лейцин, має корисний для здоров’я ефект, пов’язаний із ожирінням та діабетом 2 типу (T2D) [1, 2, 3, 4]. Однак, як це не парадоксально, нещодавно було встановлено, що підвищення рівня BCAA в крові пов'язане із збільшенням ризику розвитку T2D та резистентності до інсуліну [5, 6]. Встановлено, що BCAA в крові та їх метаболіти є перспективними біомаркерами для метаболічних порушень [7]. Було висунуто дві теорії, що пояснюють потенційний згубний вплив збільшення вмісту BCAA в крові на гомеостаз глюкози [5, 6]. Одне з них полягає в тому, що підвищення рівня BCAA стимулювало б ссавців мішень для комплексу рапаміцину 1 (mTORC1), що призвело б до роз’єднання сигналів інсуліну за допомогою фосфорилювання субстрату рецептора інсуліну (IRS). Друга гіпотеза полягає в тому, що мітотоксичні метаболіти BCAA, але не BCAA як такі, спричиняють мітохондріальну дисфункцію β-клітин і посилюють T2D. Хоча це все ще невирішене питання щодо молекулярного механізму, що лежить в основі спостережуваної асоціації збільшення BCAA з T2D, сучасні дослідження підтримують другу теорію [6, 8].
Ньюгард та ін. ретельно досліджували ефекти BCAA за допомогою щурів, яких годували дієтою з високим вмістом жиру (HFD) протягом 15 тижнів [9]. Додаткові BCAA та HFD викликали резистентність до інсуліну, тоді як парне годування з HFD відповідно до споживання калорій не призвело б до резистентності до інсуліну [9]. Також було встановлено, що добавки BCAA та HFD призвели до хронічного фосфорилювання mTOR та INS1 у скелетних м’язах та печінці, що свідчить про пригнічення сигналізації інсуліну у цих тканинах. Послідовно було встановлено, що обмеження вмісту ВСАА у жирових щурів Цукер може покращити чутливість до інсуліну в скелетних м’язах за рахунок посилення окислення жирних кислот та експорту ацил-гліцину [10]. Делеція BCATm, ферменту, який каталізує перший етап метаболізму BCAA, призводить до збільшення енергетичних витрат та поліпшення толерантності до інсуліну у мишей, у поєднанні з активацією марного циклу білкового обороту [8]. Останнім часом було встановлено, що кіназа та фосфатаза, що регулює розгалужену кетокислотну дегідрогеназу (BCKDH), вирішальний фермент катаболізму BCAA, можуть модулювати гомеостаз глюкози у жирових щурів за допомогою АТФ-цитратної ліази [11].
Хоча BCAA та особливо лейцин відіграють важливу роль у регуляції гомеостазу глюкози, на сьогодні незрозуміло, чи ефективно зниження BCAA в їжі є ефективною стратегією для покращення чутливості до інсуліну та втручання у T2D. Останнім часом було виявлено, що періодичне голодування є перспективним способом поліпшення функції β-клітин та поліпшення контролю глікемії у мишей з діабетом [21]. Періодичне голодування за допомогою дієти, що імітує голодування, здатне втручатися у прогресування діабету у мишей, збільшуючи кількість β-клітин на острівцях. Крім того, періодичне голодування за допомогою дієти, що імітує голодування, здатне зменшити фактори ризику, пов’язані з метаболічними порушеннями [22]. Проте в даний час не існує жодного дослідження, яке б поєднувало поняття "періодичне голодування" з "депривацією лейцину". У цьому дослідженні ми досліджували ідею того, чи здатний інтермітуючий дефіцит лейцину впливати на прогресування T2D у моделі діабетичної миші [6].
2. Матеріали та методи
2.1. Модель миші
Шеститижневі самці мишей C57BL/ksJ-db (db/db) були придбані у SLAC (Шанхай, Китай) і утримувались в одиночній клітці та у вільному від патогенів стані в приміщенні для тварин Шанхайського інституту біологічних наук (SIBS), Китайська академія наук (CAS). Усі миші були зважені на початку і випадковим чином розподілені на дві групи: звичайна чау з вільним доступом до пари їжі та води (CTRL, n = 8) та періодична депривація лейцину через день (LEU-, n = 8). Пара їжі (з повноцінними амінокислотами) та їжа з дефіцитом лейцину була отримана у Research Diets, Inc. (Нью-Брансвік, Нью-Джерсі, США; Cat A05080202 для L-амінокислотної дієти на гризунах без додавання лейцину та Cat A10021B для L-амінокислоти дієта на гризунах). Ці дієти були ізокалорійними та мали однаковий склад за вмістом вуглеводів та ліпідів. Крім того, клітини змінили при зміні раціону, так що миші не мали доступу до власних калових гранул. Ці експерименти проводились згідно з керівництвом Інституційного комітету з догляду та використання тварин Інституту харчових наук, SIBS, CAS з номером затвердження 2010-AN-8.
2.2. Вимірювання рівня глюкози та інсуліну в крові
Мишей голодували протягом 6 год (9:00 м. 15:00 р. М.) Перед вимірюванням глюкози в крові. Глюкозу в крові вимірювали через хвостову вену за допомогою системи моніторингу глюкози крові OneTouch UltraEasy (Lifescan, Milpitas, CA, USA). Рівні інсуліну в сироватці крові вимірювали за допомогою імуноферментного аналізу на мишах (Shanghai Enzyme-Biotechnology Co., Shanghai, China), відповідно до інструкцій виробника. Цільну кров забирали шляхом видалення очних яблук, а плазму відокремлювали центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 15 хв у мікротрубках, оброблених EDTA-K2 (Kangjian Medical, Цзянсу, Китай). Оцінка гомеостатичної моделі (HOMA) була методом, що застосовувався для кількісної оцінки резистентності до інсуліну (HOMA-IR) та функції бета-клітин (% B). HOMA-IR розраховували за такою формулою: HOMA-IR = (глюкоза натще × інсулін натще) /22,5. HOMA% B розраховували за такою формулою: HOMA-% B = (20 х інсуліну натще)/(глюкоза натще - 3,5)%.
2.3. Тестування на толерантність до глюкози (GTT) та тестування на толерантність до інсуліну (ITT)
Перед тестом мишей витримували в одній клітці і голодували протягом 4 год для ІТТ (ранкове голодування) і голодували протягом ночі для ГТТ. Внутрішньочеревно вводили глюкозу (2 г/кг) або інсулін (2 одиниці/кг). Рівні глюкози в крові вимірювали через 0, 15, 30, 60 та 90 хв після ін’єкції.
2.4. Аналіз складу тіла
Склад тіла мишей оцінювали у віці 2 місяців за допомогою echoMRI (Х'юстон, Техас, США), а дані загальної маси жиру та нежирної маси реєстрували для кожної миші, відповідно до інструкцій виробника.
2.5. Вимірювання швидкості метаболізму та фізичної активності
Миші у віці 2 місяці були випадковим чином розподілені (n = 4 для кожної групи) для тестування швидкості метаболізму та фізичної активності за допомогою комплексної лабораторної системи моніторингу тварин (CLAMS-16, Columbus Instruments, OH, США), відповідно до інструкцій виробника . Мишам дозволяли адаптуватися до системи протягом 24 годин. Поглинання кисню (VO2), вироблення діоксиду вуглецю (VCO2) та коефіцієнт дихального обміну (RER) реєстрували протягом наступних 24 годин. Переміщення контролювалося з розривів променів осі х.
2.6. Імунофлуоресцентний аналіз
2.7. Вимірювання показників сироватки та печінки
Мишей евтаназували за бажанням близько 13:00. на контрольній дієті, і кров відразу збирали з орбітальної пазухи в мікротрубки, оброблені EDTA-K2 (Kangjian Medical, Jiangsu, China). Потім мікропробірки центрифугували при 3000 об/хв протягом 15 хв і збирали надосадову рідину та зберігали при -80 ° C. Печінкові ліпіди екстрагували хлороформом/метанолом (2: 1). Рівні аспартат-трансамінази (AST) та аланін-трансамінази (ALT) у плазмі крові визначали за допомогою набору для визначення AST/ALT (ShenSuo UNF, Шанхай, Китай). Рівні тригліцеридів у плазмі та печінці (TG), загального холестерину (TC) визначали за допомогою відповідних наборів (ShenSuo UNF, Шанхай, Китай). Всі ці аналізи проводили згідно з інструкціями виробника.