Пероральна доставка дволанцюжкових РНК викликає смертність німф і дорослих азіатських цитрусових

Affiliations Laboratório de Biotecnologia, Centre de Citricultura Sylvio Moreira, Instituto Agronômico de Campinas, Cordeirópolis, São Paulo, Brazil, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, Brazil

Афілійована лабораторія біотехнологій, Центр цитрикультури Сільвіо Морейра, Інститут Агрономіки Кампінасу, Кордейпополіс, Сан-Паулу, Бразилія

Affiliation Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiróz, Університет Сан-Паулу, Пірасікаба, Сан-Паулу, Бразилія

Кафедра патології рослин, Каліфорнійський університет, Девіс, Девіс, Каліфорнія, Сполучені Штати Америки

Діого Манцано Гальдеано,
Мішель Клер Бретон,
Жоао Роберто Спотті Лопес,
Брайс В. Фальк,
Маркос Антоніо Мачадо

Цифри

Анотація

Цитування: Galdeano DM, Breton MC, Lopes JRS, Falk BW, Machado MA (2017) Пероральна доставка дволанцюжкових РНК індукує смертність німф та дорослих азіатських цитрусових псилід, Diaphorina citri. PLOS ONE 12 (3): e0171847. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0171847

Редактор: Рендалл П. Нідз, Міністерство сільського господарства США, США

Отримано: 1 серпня 2016 р .; Прийнято: 26 січня 2017 р .; Опубліковано: 10 квітня 2017 р

Наявність даних: Усі відповідні дані знаходяться в газеті та в допоміжних файлах.

Фінансування: Цю роботу підтримали Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (2013/02138-0, 2014/03925-8 і 2008/57909-2) та CNPq (573848/08-4).

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Азіатський цитрусовий псилід (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), - це комаха, що годує флоемою, та найважливіший в економічному відношенні шкідник цитрусових, головним чином тому, що він є переносником збудників клопоту (Candidatus Liberibacter) asiaticus та Candidatus Liberibacter americanus [1,2]. ГЛБ зустрічається в усіх районах вирощування цитрусових Азії, Африки та Америки і є найважливішою хворобою, що вражає цитрусові у всьому світі, що призводить до зниження дерев, зниження якості плодів та загибелі дерев [3–5]. Як дорослі, так і німфи АКТ можуть передавати бактерії, а коли вони потрапляють у німфи, бактерії можуть зберігатися і передаватися після появи дорослих, що припускає, що збудник розмножується і циркулює в АКТ [6]. Більше того, бактерії можуть передаватися з низькою швидкістю від заражених самок трансваріально до своїх нащадків [7] та від заражених самців до неінфікованих самок під час спарювання [8].

Для боротьби з популяціями D. citri виробники цитрусових використовують кілька різних інсектицидів [9]. Однак невибіркове та постійне використання цих інсектицидів може призвести до стійкості до шкідників, що незмінно призводить до збільшення витрат на виробництво [10]. Головною проблемою для дослідників була розробка ефективних стратегій боротьби з D. citri з незначним впливом на навколишнє середовище, наприклад використання ектопаразитоїда Tamarixia radiata (Hymenoptera: Eulophidae) [11] як природного хижака [12], ентомопатогенних грибів [13]. і нещодавно РНК-інтерференція (RNAi) [14–16].

RNAi є потужним інструментом для вивчення функціональної геноміки еукаріотів, включаючи комах [17]. Відкриття дволанцюжкової РНК (dsRNA) опосередкованого генно-специфічного мовчання у нематоди Caenorhabditis elegans [18] дозволило опосередковану dsRNA RNAi застосовувати до різних сільськогосподарських комах для замовчування конкретних генів [19].

Першим кроком для успішного проведення РНК у комах є визначення зручного та надійного методу доставки дсРНК до цільового гена. Мікроін’єкції, замочування та годування зазвичай застосовуються для доставки дсРНК у комах [20]. Повідомлялося про успішні ефекти збиття мРНК шляхом штучного вигодовування дсРНК у комах-шкідників сільськогосподарських культур, включаючи псиліду картоплі/помідора (Bactericera cockerelli), білокрилок (Bemisia tabaci), західного кукурудзяного хробака (Diabrotica virgifera virgifera), горохової попелиці (Acyrthosiphon pisum), бавовняний черв'як (Helicoverpa armigera), східна плодова муха (Bactrocera dorsalis), буряковий армійський черв’як (Spodoptera exigua) та коричневий саджанець (Nilaparvata lugens) [21–29]. Однак важко використовувати штучне вигодовування дРНК під час ювенільних стадій деяких комах; таким чином, була розроблена ефективна система для пригнічення генів німф білокрилок за допомогою опосередкованого листками живлення dsRNA [30]. Більше того, деякі дослідження продемонстрували, що неефективність пероральної доставки RNAi серед видів комах обумовлена швидкою деградацією dsRNA, яка, ймовірно, індукується ферментами нуклеаз у просвіті кишечника [31,32] або в слині [33], таким чином, для цих видів комах кращим способом доставки дРНК є ін’єкція голої дРНК у порожнину тіла [34].

У цьому дослідженні ми досліджували вплив РНК на дорослих та німф D. citri, яких годували генно-специфічними дРНК, націленими на катепсин D, хітинсинтазу та інгібітор апоптозу за допомогою штучної дієти та через листя рослин. Ми показали, що обидва способи доставки dsRNA є ефективними у приглушенні генів АСР, збільшуючи рівень смертності з часом і регулюючи вниз гени-мішені.

Матеріали і методи

Комахи та рослини

ACP вирощували в цитрусових макрофілах у клітинах із сіткою, що підтримувались при 25 ± 2 ° C, протягом 14:10 год (світло: темно) фотоперіоду та відносної вологості повітря від 60 до 70% (RH), у Зміщеній дослідницькій установі (CRF) Університету Каліфорнія, Девіс (Каліфорнія, США; http://crf.ucdavis.edu/). Для аналізу годування на штучному харчуванні та в листках Murraya paniculata (L) Jack (Rutaceae) використовували, відповідно, кілька дорослих АСР та спарених самок.

Виділення РНК та синтез кДНК

Загальну РНК виділили з пулу з десяти живих АСР, використовуючи ZR Tissue and Insect Microprep ™ (Zymo Research, Ірвін, Каліфорнія, США, номер каталогу D6015), а геномну ДНК видалили з зразків за допомогою набору ДНКази I (Zymo Research, Ірвін, Каліфорнія, США, номер каталогу E1010) згідно з протоколом виробника. Концентрацію та чистоту визначали за допомогою спектрофотометра NanoDrop ND 8000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA). Синтез кДНК виконували за допомогою iScript ™ зворотної транскрипції Supermix (Bio-Rad ®, Геркулес, Каліфорнія, США, каталог № 170–8841) відповідно до протоколу виробника.

Ідентифікація, дизайн праймерів та ампліфікація генів-мішеней

Для ідентифікації катепсину D, хітинсинтази та інгібітора генів апоптозу АСР було проведено анотування послідовностей транскриптому D. citri шляхом скринінгу банку даних Psyllid.org (http://psyllid.org/download) на основі амінокислотних послідовностей комах, депонованих у NCBI (Acyrthosiphon pisum, Aedes aegypti, Anopheles gambiae, Apis florea, Apis mellifera, Bombus impatiens, Bombus terrestris, Drosophila melanogaster, Drosophila pseudoobscura) за допомогою BlastX. Праймери та зонди були розроблені за допомогою інструменту PrimerBlast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) (Таблиця 1). Продукт ПЛР, що відповідає послідовності GFP, ампліфікували з плазміди pJL24. ПЛР проводили із застосуванням стандартних процедур (Sambrook, 2012) з GoTaq ® ДНК-полімеразою (Promega Corporation, Madison, WI). Фрагменти аналізували на 1% агарозних гелях, що містять 1% безпечної ДНК SYBR ® (Invitrogen ®). Послідовності ампліконів підтверджували секвенуванням.