Подовження життя у дрозофіли шляхом годування препаратом PNAS
Внесок Сеймура Бензера
Анотація
Ми повідомляємо, що годування дрозофіли протягом дорослого віку 4-фенілбутиратом (PBA) може значно збільшити тривалість життя без зменшення рухової сили, стійкості до стресу або репродуктивної здатності. Лікування протягом обмеженого періоду, на ранніх або пізніх стадіях дорослого життя, також ефективно. Мухи, що харчуються PBA, демонструють глобальне збільшення ацетилювання гістонів, а також різко змінений характер експресії генів, включаючи індукцію або репресію численних генів. Затримка старіння може бути наслідком зміненого фізіологічного стану.
Старіння - це поширене біологічне явище, яким поділяють тварини та рослини (1), але наше розуміння того, чому та як ми старімо, залишається обмеженим. Великий біологічний інтерес та практичне значення було б, якби ми могли зрозуміти молекулярні основи старіння, навчитися затримувати процес старіння та підтримувати бадьорість молодості.
Недавні дослідження показують, що довголіття можна змінити за допомогою генетичних маніпуляцій у різних організмах. Мутації вік-1 (2), daf-2 (3, 4) та clk-1 (5) у Caenorhabditis elegans збільшують тривалість життя хробака. У дріжджах гени Сіра продовжують тривалість життя материнської клітини (6). Тривалість життя дрозофіли збільшується за рахунок мутацій G-зв'язаного з білками рецептора в methuselah (7), котранспортера дикарбоксилату натрію в Indy (8), субстрату рецептора інсуліну в chico (9) або інсуліноподібного рецептора в InR (10) . Нещодавно були розглянуті дослідження дрозофіли трансгенними методами (11). Очевидно, великий інтерес представляє відкриття препаратів, які можуть продовжити тривалість життя простим годуванням. Показано, що міметики супероксиддисмутази та каталази продовжують тривалість життя C. elegans (12). Вивчаючи механізм дії препарату на нейродегенеративні мутанти (13), ми виявили, що 4-фенілбутират натрію (PBA) може збільшити як медіану, так і максимальну тривалість життя дрозофіли.
Нижче ми представляємо висновок про продовження тривалості життя дрозофіли шляхом годування PBA, разом із даними про зміни ацетилювання гістону та спектру генів, індукованих та пригнічених PBA.
Матеріали і методи
Штами Fly та фенілбутират.
Використовували штами дрозофіли w 1118 та дикого типу Canton-S. Кислота PBA, натрієва сіль, була щедрим подарунком Джозефа Купера з Медісіс, Скоттсдейл, Арізона. Як повідомляється, чистота хімічної речовини становить 99,6%.
Визначення тривалості життя.
Щойно закритих мух збирали та вирощували у звичайному агаровому середовищі з кукурудзяного борошна (28). Для кожного експерименту 10 флаконів, кожна з яких містить 20 мух, підтримували при 29 ° C або 25 ° C і переносили у свіжі флакони кожні 3 дні. Кількість загиблих мух підраховували щодня.
Мембранна гібридизація.
Для синтезу зондів для гібридизації використовували розумний набір для синтезу кДНК ПЛР (CLONTECH). Загальну РНК готували з мух, яких годували протягом 10 днів при 29 ° С середовищем, що містить 10 мМ PBA, або звичайним середовищем. Після першого ланцюгового синтезу кДНК за допомогою зворотної транскриптази вірусу мишачого лейкозу Малоні (MMLV) кДНК посилювали методом ПЛР, реакція складала 95 ° C протягом 1 хв, а потім 24 цикли по 15 секунд при 95 ° C, 30 секунд при 65 ° C та 6 хв при 68 ° C. Зонди готували методом випадкового грунтування ДНК-мічення з [α- 32 P] dCTP. Фільтри, що містять 7500 унікальних клонів дрозофіли EST (Research Genetics, Huntsville, AL), попередньо гібридизували протягом 4 год, потім додавали зонди для гібридизації протягом 16 год при 58 ° С в буфері, що містить 1 М NaCl, 0,05 М Трис (рН 8,0), 5 мМ EDTA, 1% SDS та 10% декстрану сульфату. Після гібридизації фільтри промивали кілька разів і піддавали дії рентгенівської плівки для виявлення генів, індукованих або репресованих PBA.
Зворотно-північні плями.
Для кількісного визначення кількості ряду окремих транскриптів за допомогою ПЛР було синтезовано ≈ 500 пар основ кожного гену-кандидата, а 100 нг встановлено на нейлонову переносну мембрану (hybond-N +, Amersham Pharmacia). Новонароджених дорослих мух годували стандартною їжею для мух, що містить 10 мМ PBA, або звичайною їжею, протягом 10 днів при 29 ° C. РНК Messenger витягували і використовували для синтезу кДНК за допомогою MMLV-зворотної транскриптази, а зонди готували випадковим праймуванням та [α- 32 P] dCTP. Нейлонову мембрану, що містить гени-кандидати, гібридизували з зондом, приготовленим з контрольних мух, і піддавали впливу екрану PhosphorImager (Molecular Dynamics). Після витримки зонд видаляли в 10 мМ EDTA/0,1% SDS при 80 ° C і піддавали впливу екрану PhosphorImager протягом 18 годин, щоб підтвердити, що залишковий зонд не залишився. Потім мембрану знову гібридизували з другим зондом, приготованим із мух, що харчуються PBA. Кількісний рівень експресії кожного гена визначали за допомогою програми IMAGE QUANT (Molecular Dynamics).
Вестерн-блотинг гістонів.
Для підготовки гістонів використовували партії 100 мух (29). Гомогенати цілих мух центрифугували при 2500 × g протягом 10 хв у середовищі, що містить 0,05 М гліцину, 10 мМ малеату калію Тріс, 5 мМ MgCl2 та 10 мМ меркаптоетанолу (рН 7,3), щоб позбутися клітинних залишків. HCL додавали до супернатанту до кінцевої концентрації 0,25 М, яку витримували на льоду протягом 1 години. Кислоторозчинні білки відновлювали центрифугуванням при 13000 об/хв протягом 10 хв при 4 ° C, потім для осадження білків додавали трихлороцтову кислоту (TCA). Десять мікрограмних зразків білків завантажували в 16,5% поліакриламідний гель для електрофорезу, потім переносили на полі (вінілідендифторид) (PVDF) мембрану з наступною гібридизацією з антитілами до ацетильованих і неацетильованих H3 і H4 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, Нью-Йорк). Щоб перевірити, що будь-який залишковий PBA в мухових тілах не впливатиме на ацетилювання гістонів під час їх очищення, ми додали 30 мМ PBA до гомогенатного буфера перед виділенням ядер та гістонів, і не виявили різниці.
Результати і обговорення
Щоб перевірити дію PBA in vivo, ми годували нещодавно закритих мух штаму w 1118 протягом усього життя стандартним мухоносним середовищем (кукурудзяна мука, агар, декстроза, дріжджі; посилання 28), що містить різні концентрації препарату (0, 0,1, 1, 2,5, 5, 10, 20 і 40 мМ). Тривалість життя вимірювали як при 29 ° C, так і при 25 ° C. Десять мілімолярних PBA показали вражаюче продовження як середньої, так і максимальної тривалості життя (рис. 1а і в). При більш високих концентраціях, 20 мМ і 40 мМ, PBA був очевидно токсичним, зменшуючи виживання; існує вузький діапазон концентрації PBA, що ефективно для продовження тривалості життя. Щоб визначити, чи препарат також ефективний для іншого штаму дрозофіли, ми також виміряли вплив PBA на тривалість життя штаму дикого типу Canton-S (C-S), використовуючи 0, 2, 5 та 10 мМ PBA. П'ять мілімолярів збільшили тривалість життя так само, як і 10 мМ із штамом w 1118 (рис. 1b), тоді як 2 мМ не мали ефекту, а 10 мМ були токсичними. Таким чином, оптимальна концентрація PBA, як видається, змінюється залежно від генетичного фону. Як показано нижче, ступінь інгібування деацетилази гістону також однаково відрізнялася між цими двома штамами.