Полудневе харчування не погіршує пам’ять миші Наукові звіти
Предмети
Анотація
Вступ
Нічні щури та миші, які мають вільний доступ до їжі, активні і їдять переважно вночі під контролем світло-темного (LD), що піддається введенню в дію циркадного кардіостимулятора в супрахіазматичному ядрі (SCN). Якщо доступність їжі обмежується до середини світлового періоду протягом тижня або більше, виникає напад активності в очікуванні щоденного прийому їжі 1,2,3, і циркадні годинники в більшості периферичних органів і тканин зміщуються до рівня прийому їжі 4, 5. Ці циркадні коригування добових графіків годування не залучають кардіостимулятора SCN, оскільки SCN, коли входить у цикли LD, не зміщується при денному годуванні 6,7,8, а абляція SCN не порушує ритми, що передбачають їжу, або запобігає захопленню периферійних годинник до запланованого годування 9,10,11 .
Методи
Тварини та житло
Молоді самці мишей C57BL/6 (N = 110, вік 2–4 місяці) були отримані з річки Чарльз (QC, Канада). Окремі когорти використовувались для тестування NOR у Y-лабіринті (експеримент 1, N = 34) та у відкритому полі (експеримент 2, N = 37). Третя когорта (N = 40) була використана для перевірки спонтанного чергування (експеримент 3a) та контекстуального кондиціонування страху (експеримент 3b). Усі миші були одноразово розміщені в циклі 12:12 LD (білий світлодіод,
15 люкс на дні клітки) з наявністю їжі та води ad libitum принаймні за два тижні до обмеженого годування. Кімнатну температуру підтримували на рівні
22 ° C. В експерименті 1 рухову активність реєстрували безперервно, використовуючи програмне забезпечення збору та аналізу даних Clocklab (Actimetrics, США). Усі процедури були схвалені Комітетом з догляду за тваринами університету Саймона Фрейзера (протокол 1208P-16), і всі експерименти проводились відповідно до відповідних рекомендацій та правил.
Обмежене годування
Мишей в експерименті 1 (тест N-Y-лабіринт) витримували за обмеженим графіком годування щонайменше 40 днів перед тестуванням, щоб забезпечити стабільне входження в графік годування. Графік було розпочато з 18-годинної депривації їжі, починаючи з Zeitgeber Time (ZT) 12 (де ZT0 увімкнено, за згодою). Потім їжа надавалась щодня на ZT3 (3 год. Після ввімкнення світла; денне харчування) або ZT15 (3 год. Після вимкнення світла; нічне годування). Тривалість прийому їжі становила 10 годин у перший день, зменшувалась на 1 год/день протягом наступних чотирьох днів і підтримувалась на рівні 6 годин (ZT3–9 або ZT15-21) до кінця тестування NOR. Вживану їжу та масу тіла вимірювали щодня протягом перших 2 тижнів.
Миші в експерименті 2 (тест NOR на відкритому грунті) та експерименті 3 (спонтанне чергування та контекстні тести на кондиціонування страху) підтримувались за обмеженим графіком годування, як описано Лохом та ін. 12. Відповідно, мишей позбавляли їжі протягом 24 годин, а потім забезпечували їжею протягом 6 год/день із ZT3-9 або ZT15-21 протягом 2 тижнів, причому процедури тестування починалися з 15 дня обмеженого годування.
Графіки експериментів та апаратура для кожного експерименту проілюстровані на додатковому малюнку S1.
Експеримент 1: Тест NOR в апараті Y-лабіринт
Y-лабіринт має переваги перед відкритим полем для тестів пам'яті об'єктів. Вузькі плечі Y-лабіринту зменшують тривожність і, отже, спонукають до дослідження. Високі стіни обмежують використання просторових реплік, заохочуючи увагу до предметів. Y-лабіринт був виготовлений з однорідного непрозорого білого Перспексу (описаного в 24). Стіни мали висоту 30 см, а кожна рука була довжиною 16 см і шириною 8 см. Цифрова відеокамера була встановлена над лабіринтом для запису всіх випробувань. Одну руку використовували як стартову, а інші дві - для презентації предметів, закріплених на підлозі лабіринту за допомогою Blu-tack TM. Лабіринт і предмети протирали 50% -ним розчином етанолу і висушували між випробуваннями. Використовувані об’єкти та бік лабіринту, в якому був представлений новий об’єкт, були врівноважені. Всі випробування в Y-лабіринті проводились при слабкому світлі (біле розжарювання,
Миші звикли до щадного поводження за 3-4 сеанси обробки, що повторювались щодня протягом
За 2 тижні до тестування NOR. Мишей звикли до Y-лабіринту, поміщаючи в апарат на 10 хв кожного з двох днів безпосередньо перед першим тестом NOR. Кожен тест NOR складався з двох ознайомчих випробувань та одного вибору, запланованих з інтервалом у 24 години протягом наступних днів. Під час ознайомчих випробувань мишей розміщували в одному кінці Y-лабіринту з двома однаковими предметами на інших двох кінцях і дозволяли досліджувати протягом 5 хв. Під час вибору випробувань мишей поміщали в Y-лабіринт і подарували один знайомий об'єкт, який був ідентичним об'єктам, представленим на етапі ознайомлення, і один Роман предмет, з яким миші раніше не стикалися. Мишам давали 5 хв для дослідження лабіринту та предметів. Потім мишей повертали у свої домашні клітини та витримували обмежені графіки годівлі ще 4 дні. Потім 3-денну тестову послідовність повторювали в інший час доби, і повну 7-денну послідовність повторювали, поки кожна миша не була протестована у всіх чотирьох часових точках (ZT3, 9, 15 та 21, зрівноважена для замовлення).
На рівень пошукової активності впливає голод. Тому протягом 24 годин перед кожним випробуванням мишам забезпечували невеликий прийом їжі (25% середньодобового споживання їжі) кожні 6 год (ZT3, 9, 15 та 21), замість одного великого прийому їжі при ZT3 або ZT15. Це гарантувало, що час після тривалого годування був рівноцінним для кожного вибору.
Експеримент 2: Тест NOR на апаратах відкритого поля
Процедури, використані в експерименті 2, мали на меті відповідати процедурам Лоха та ін. 12 якомога ближче. Відповідно, тестування проводили в непрозорих білих коробках (55 × 37 × 33 см). Об'єкти (з експерименту 1) були розміщені в центрі, на однаковій відстані один від одного та боків відкритого поля. Тестування на ZT9 проводилося при світлі (
30 люкс) та тестування на ZT21 при слабкому червоному світлі (0,5 представляють перевагу новинки.
Екстракція гіпокампу та кількісна ланцюгова реакція полімерази
Циркадні ритми зумовлені авторегуляторними петлями зворотного зв'язку транскрипції та трансляції, що залучають групу тактових генів, що включає Bmal1 і За2 25. Гени годинника відповідають за циркадні коливання на клітинному рівні, і експресія може бути використана для оцінки тканиноспецифічної циркадної фази. На наступний день після тестування NOR та останнього запланованого прийому їжі мишей, що годувались удень та вночі, в експерименті 2 евтаназували через CO2 при ZT3, 6, 9 або 15, не годуючи цього дня. Мишей обезголовили, а мозок швидко екстрагували та охолодили в крижаному збалансованому розчині солі Хенка (HBSS; Millipore-Sigma H1641, Сент-Луїс, Міссурі), доповненому буфером Hepes (Millipore-Sigma H0887, St Louis, MO) та NaCHO3 ( Millipore-Sigma S8761, Сент-Луїс, Міссурі). Мозок підтримували в ділянці HBSS 4 ° C та 1100 мкм, починаючи з
1,58 мм ззаду від брегми 26 були розділені на вібратомі. Спинний гіпокамп відокремлювали за допомогою скальпеля і негайно поміщали у 2 мл пробірку Еппендорфа та заморожували на сухому льоду. Тканину витримували при -80 ° C до виділення РНК. РНК виділяли за допомогою реагенту Trizol (Thermo Fisher Scientific, 15596018, Waltham, MA) відповідно до інструкцій виробника, і концентрації визначали кількісно за допомогою спектрометра. РНК (500 нг) була зворотно транскрибована в кДНК за допомогою набору для зворотної транскрипції кДНК високої ємності (Thermo Fisher Scientific, 4368814, Waltham, MA). Кількісна ланцюгова реакція полімерази (qPCR) За2 проводили з використанням 2 мкл кДНК із SYBR Green FastMix (Quanta Biosciences, 95073, Gaithersburg, MD) у системі ПЛР у реальному часі StepOnePlus (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). експресія мРНК За2 і Bmal1 було нормалізовано до Rplp0. Використовувані праймери наведені в додатковій таблиці S1.