Порівняльне експериментальне дослідження ефективності моно- та мультипробіотичних штамів у
Анотація
Передумови
Дослідити ефективність різних пробіотичних штамів, їх комбінацій та форм (живих або ліофілізованих) при профілактиці неалкогольної жирової хвороби печінки (НАЖХП).
Методи
Результати
Введення MSG протягом неонатального періоду призводить до розвитку НАЖХП у 4-місячних щурів. Щодо ступеня стеатозу не було суттєвої різниці між групою ожиріння MSG та групами ліофілізованих монокомпонентних пробіотиків (III – V). Найвищий прояв стеатозу спостерігався для B. animalis ВКЛ групи (2,0 ± 0,25) порівняно з B. animalis ВКБ (1,70 ± 0,21) та L. casei IMVB-7280 (1,80 ± 0,20). Зміни балів стеатозу між усіма групами монопробіотиків (III – V) були незначними. Введення з народження як живої (VII), так і ліофілізованої (VI) пробіотичної суміші призводить до значного зменшення на 69,5% (стор
Передумови
Безалкогольна жирова хвороба печінки (НАЖХП) варіюється від простого стеатозу до неалкогольного стеатогепатиту (НАСГ), який може мати різну ступінь фіброзу та прогресувати до цирозу печінки та гепатоцелюлярної карциноми [1]. НАЖХП, що асоціюється з ожирінням та діабетом 2 типу, має загальну поширеність 15–20% серед загальної популяції та 76–90% серед людей із ожирінням [2]. В даний час НАЖХП є основною причиною хронічних захворювань печінки [3, 4], що призвело до значних проблем зі здоров'ям, таких як захворюваність, смертність та трансплантація печінки [5].
Згідно з моделлю Двое із двох ударів про патогенез НАЖХП, інсулінорезистентність як перший удар викликає накопичення ліпідів у гепатоцитах та призводить до розвитку жирової печінки. Другий удар включає клітинні порушення, такі як окислювальний стрес та окислення ліпідів, що пошкоджує клітини печінки та викликає запальний процес, що призводить до патологічних змін у гепатоцитах, що призводять до НАСГ [6]. Недавні дослідження дають чіткі докази того, що мікробіота кишечника сильно причетна до патогенезу та перебігу НАЖХП через декілька механізмів [7].
Основними механізмами, які пов'язують змінений склад мікробіоти кишечника з НАЖХП, є модуляція метаболізму дієтичного холіну [8] та вироблення ендогенного етанолу [9], підвищення проникності кишечника [10] з подальшою ендотоксемією та метаболічним запаленням низького ступеня [11], посилення енергетичний збір з дієти [12] та порушення синтезу коротколанцюгових жирних кислот [13], зниження всмоктування вітамінів та біологічно активних сполук [12], зміна метаболізму жовчних кислот та сигналізація FXR/TGR5 [14]. Пребіотики та пробіотики мають фізіологічні функції, що сприяють здоров’ю мікробіоти кишечника та/або відновленню мікрофлори, підтримці здорової маси тіла та контролю факторів, пов’язаних з НАЖХП, за допомогою різних вищезазначених шляхів [15].
У нашій попередній роботі ми показали, що періодична обробка мультипробіотиками, що містять біомасу 14 живих штамів (Лактобактерії, лактококи, Біфідобактерії, Propionibacterium, Ацетобактер) запобігає, принаймні частково, індуковане MSG ожиріння [16] та розвиток НАЖХП [17]. Однак питання щодо ефективності різних пробіотичних штамів, їх поєднання та форми (живих або ліофілізованих) при лікуванні НАЖХП залишається відкритим, що і сформувало цілі поточного дослідження.
Методи
Тварини
Це дослідження було проведено у суворій відповідності з рекомендаціями Керівництва з догляду та використання лабораторних тварин Національного інституту охорони здоров'я та загальних етичних принципів експериментів на тваринах, затвердженого Першим національним конгресом з біоетики в Україні (вересень 2001 р.) . Протокол затверджений Комітетом з етики експериментів на тваринах Київського національного університету імені Тараса Шевченка (номер протоколу: 10/2014). Щурів утримували в колективних клітках в контрольованих умовах температури (22 ± 3 ° С), світла (12 год цикл світло/темрява) та відносної вологості (60 ± 5%). Тварин годували лабораторною чау (PurinaW) та водою з-під крану у разі необхідності.
Дизайн експерименту
Дослідження включало 70 самців щурів Wistar, розділених на 7 груп, по 10 тварин у кожній (рис. 1). Новонародженим щурам контрольної групи (I) вводили фізіологічний розчин підшкірно (с.к.) в обсязі 8 мкл/г на 2-й, 4-й, 6-й, 8-й і 10-й післяпологові дні. Новонародженим щурам груп II – VII вводили розчин глутамату натрію (MSG) (4,0 мг/г маси тіла) с. на 2, 4, 6, 8 і 10 післяпологові дні [18]. Неонатальне введення MSG викликає значне накопичення жиру в черевній порожнині дорослих щурів. Це відбувається через вплив нейротоксичності на дугоподібне та вентромедіальне ядра гіпоталамуса [19]. У нашій попередній роботі ми продемонстрували розвиток НАЖХП в умовах важкого вісцерального ожиріння, викликаного MSG [17]. Таким чином, отримані результати підтвердили обґрунтованість використання MSG для розвитку НАЖХП.
III – VII групи лікували пробіотиками. III – V групи отримували ліофілізовані монопробіотики B. animalis ВКЛ, B. animalis ВКБ, L. casei IMVB-7280 відповідно. Група VI отримала суміш цих трьох пробіотичних штамів. VII групу лікували мультипробіотиком «Симбітер», який постачав Науково-виробнича компанія «О.Д. Пролісок ”. Він містить 14 живих пробіотичних штамів Лактобактерії + Лактокок (6 × 10 10 КУО/г.), Біфідобактерії (1 × 10 10/г.), Propionibacterium (3 × 10 10/г.), Acetobacter (1 × 10 6/г.) родів.
Введення розпочали наприкінці 4-го тижня після народження і продовжували періодично, чергуючи 2-тижневий курс та 2-тижневі інтервали без лікування. Протягом 4 місяців після народження щури мали нормальну дієту. Всі параметри вимірювали у щурів 4 місяців.
Збір зразків та біохімічний аналіз крові
Щурів усіх груп голодували приблизно протягом 12 годин до жертви. Щурів приносили в жертву шляхом вивиху шийки матки під уретановим наркозом. Кров брали з верхівки серцевого шлуночка, і кілька крапель крові збирали в мікроцентрифужну пробірку, що містить суміш NaF та ЕДТА, у співвідношенні 2: 1 (ж/б) співвідношення. Зразок крові збирали у стерильну пробірку та центрифугували при 3500 об/хв (2260 г) протягом 15 хв. Після центрифугування сироватку супернатант для подальшого аналізу розподіляли у пробірки для мікроцентрифуги та зберігали при -80 ° C. Білірубін, активність аланіну та аспартатамінотрансферази в сироватці крові визначали стандартними біохімічними методами.
Оцінка гістології печінки
Для гістологічного аналізу брали зразки тканини печінки як з правої, так і з лівої печінкової часток (розмір зразка 0,5 × 0,5 см). Після фіксації протягом 24 год у рідкій буені фрагменти печінки зневоднювали у спирті зростаючих концентрацій (від 70 до 96 °), вкладали у парафін, а потім розрізали товщиною 5–6 мкм і фарбували гематоксилін-еозином. Патолог, засліплений груповим розподілом, провів гістологічний аналіз предметних стекол за допомогою світлової мікроскопії («Олімп», Японія). Для оцінки морфологічних змін у печінці ми використовували NAS (показник активності NAFLD), який включає гістологічні особливості і визначався як незважена сума балів за стеатоз (0–3), часточне запалення (0–3) та балонування (0–2) ). Відповідно до оцінок NAS ≥5 діагностується як безалкогольний стеатогепатит (NASH) та випадки з тестом NAS 2. Різниця між групами була визначена статистично значущою, коли a стор-значення було менше 0,05.