Поширена помилкова локалізація FUS є молекулярною ознакою аміотрофічного бічного склерозу
Джулія Е Тайзак
1 Інститут Френсіса Крика, 1 Мідленд-роуд, Лондон, Великобританія
2 Відділ нервово-м'язових захворювань, Інститут неврології Queen Square, Королівська площа, Лондон, Великобританія
Рафаель Луїзьє
1 Інститут Френсіса Крика, 1 Мідленд-роуд, Лондон, Великобританія
Доаа М Таха
1 Інститут Френсіса Крика, 1 Мідленд-роуд, Лондон, Великобританія
2 Відділ нервово-м'язових захворювань, Інститут неврології Queen Square, Королівська площа, Лондон, Великобританія
Джейкоб Нівз
1 Інститут Френсіса Крика, 1 Мідленд-роуд, Лондон, Великобританія
2 Відділ нервово-м'язових захворювань, Інститут неврології Queen Square, Королівська площа, Лондон, Великобританія
Миха Модіч
1 Інститут Френсіса Крика, 1 Мідленд-роуд, Лондон, Великобританія
2 Відділ нервово-м'язових захворювань, Інститут неврології Queen Square, Королівська площа, Лондон, Великобританія
Джеймі Мітчелл
1 Інститут Френсіса Крика, 1 Мідленд-роуд, Лондон, Великобританія
2 Відділ нервово-м'язових захворювань, Інститут неврології Queen Square, Королівська площа, Лондон, Великобританія
Іоне Мейєр
2 Відділ нервово-м'язових захворювань, Інститут неврології Queen Square, Королівська площа, Лондон, Великобританія
Лінда Грінсміт
2 Відділ нервово-м'язових захворювань, Інститут неврології Queen Square, Королівська площа, Лондон, Великобританія
Джіа Ньюкомб
3 NeuroResource, Департамент нейрозапалення, Інститут неврології UCL Queen Square, Королівська площа, Лондон, Великобританія
Джерней Уле
1 Інститут Френсіса Крика, 1 Мідленд-роуд, Лондон, Великобританія
2 Відділ нервово-м'язових захворювань, Інститут неврології Queen Square, Королівська площа, Лондон, Великобританія
Ніколас М Лускомб
1 Інститут Френсіса Крика, 1 Мідленд-роуд, Лондон, Великобританія
4 UCL Genetics Institute, University College London, Gower Street, London, UK
5 Вищий університет Окінавського інституту науки і техніки, Окінава 904–0495, Японія
Рікі Патані
1 Інститут Френсіса Крика, 1 Мідленд-роуд, Лондон, Великобританія
2 Відділ нервово-м'язових захворювань, Інститут неврології Queen Square, Королівська площа, Лондон, Великобританія
Пов’язані дані
Дані, що підтверджують результати цього дослідження, можна отримати у відповідного автора на обґрунтований запит.
Анотація
Дивіться Відаля та Аткіна (doi: 10.1093/brain/awz256), щоб отримати науковий коментар до цієї статті.
Вступ
Бічний аміотрофічний склероз (АЛС) - це невблаганно прогресуючий нейродегенеративний стан, який залишається невиліковним через наше неповне розуміння молекулярного патогенезу. Генетичні відкриття при ALS сильно впливають на всюдисущо виражені регулятори РНК-обробки (Taylor et al., 2016). Патологічно у 97% випадків білок TDP-43 неправильно локалізується від ядра до цитоплазми, де він агрегує (Neumann et al., 2006). Однак мутації, що спричиняють ALS, у зрощеній саркомі (FUS) та супероксиддисмутазі 1 (SOD1) у більшості випадків помітно не мають протеїнопатії TDP-43 (Mackenzie et al., 2007). Агрегація FUS є визнаною особливістю ALS, пов'язаного з мутацією FUS (Vance et al., 2009). Однак концепція того, що FUS дикого типу від ядерної до цитоплазматичної неправильної локалізації (а не агрегації) може бути більш розповсюдженою особливістю інших форм ALS, досі нам не була систематично оцінена. Дійсно, така помилкова локалізація досі могла уникнути виявлення через упередженість щодо вивчення агрегатів/включень, а не порушену субклітинну локалізацію лише неагрегованих білків. Ця можливість посилюється фактами, що (i) порушення ядерно-цитоплазматичної компартменталізації дедалі більше визнається ключовою особливістю ALS (Boeynaems et al., 2016); і (ii) FUS, як відомо, переміщається між ядром і цитоплазмою.
Тут ми систематично досліджували локалізацію білка FUS у моделі індукованої людиною плюрипотентних стовбурових клітин (iPSC), трансгенних моделях миші та тканині людини після забою з багатьох випадків спорадичного ALS. Ми виявили, що неправильна локалізація FUS від ядер до цитоплазми є більш поширеною особливістю ALS, ніж визнано раніше. Крім того, ми представляємо докази, які підтверджують передбачуваний молекулярний механізм цієї неправильної локалізації через взаємодію між білком FUS та аберрантною транскрипцією SFPQ, що зберігає інтрон.
Матеріали і методи
Індукована плюрипотентна культура стовбурових клітин та диференціація рухових нейронів
IPSC підтримувались із використанням стандартних протоколів. Диференціацію рухових нейронів проводили, як було описано раніше (Hall et al., 2017; Luisier et al., 2018). Детальнішу інформацію див. У Додатковому матеріалі. Детальна інформація про лінії iPSC наведена в додатковій таблиці 1.
Тварини, трансгенні моделі та обробка тканин
Посмертна тканина людини
Зрізи заморожених тканин отримані з поперекових відділів спинного мозку восьми здорових донорів та 12 вікових та статевих спорадичних хворих на БАС (Додаткова таблиця 2). Смерть до часу затримки заморожування також була порівнянна між групами [середня затримка ± стандартне відхилення (SD): 30,13 ± 12,87 та 27,75 ± 10,63 год, для контрольних та спорадичних пацієнтів з БАС відповідно]. Зразки спинного мозку були отримані з тканинного банку NeuroResource, Інститут неврології UCL, Лондон, Великобританія. Зразки були передані в банк тканин за письмовою згодою донорів тканин після етичної перевірки Комітетом NHS NRES Лондон-Центральна та зберігаються під ліцензією дослідницького сектору Управління людських тканин Великобританії (HTA). У цьому дослідженні випадки ALS вважалися епізодичними через відсутність будь-якої сімейної історії хвороби рухових нейронів. Крім того, всі випадки виявляли патологію TDP-43 при скринінгу NeuroResource, припускаючи, що вони не є мутантами SOD1 [оскільки патологія TDP-43 відсутня у випадках ALS, пов’язаних з SOD1 (Mackenzie et al., 2007)].
Імуномаркування, візуалізація та аналіз зображень
Фракціонування клітин, екстракція РНК, зворотна транскрипція та кількісна ПЛР
Флуоресценція однієї молекули in situ гібридизація
Зонди були розроблені з використанням програмного забезпечення Probe Designer від Biosearch Technologies і надані тим самим постачальником. Включені зонди були розроблені проти SFPQ-інтрону, кон'югованого з Quasar®570 (SMF-2037-1), і зрілого SFPQ, кон'югованого з Quasar®670 (послідовності зондів доступні за запитом). Кількісне визначення сигналу гібридизації проводили за допомогою власного алгоритму виявлення інтенсивності плями в сегментованих клітинах DAPI для розділення ядерного та цитоплазматичного сигналів.